[发明专利]GAP启动子文库及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及用于毕赤酵母的GAP启动子文库。

背景技术

通过基因操作优化细胞代谢网络的代谢工程(Metabolic Engineering)正在成为生物化工领域一个非常重要的前沿研究方向。但是，面对微生物细胞内由基因、蛋白、代谢物、各种信号分子及它们之间相互作用组成的复杂动态网络，代谢过程的分析和调控非常复杂和困难。只有通过对基因表达进行精密的微调来研究其对细胞表型和代谢流的影响，才能从中解析出关键的可供改造的代谢节点。因此，精确的“开量”式基因微调是开展代谢工程研究非常重要的先进手段，对其开展研究具有重要的科学意义广泛的应用空间。

启动子(Promoter)是基因表达调控最常用的元件。但是，无论是组成型(Constitutive)，还是诱导型(Inducible)启动子，都无法在一个较宽的范围内对基因表达强度进行连续的调控。尽管诱导型启动子可通过诱导时间和诱导物浓度在一定程度上调控基因的表达，但这种调节的本质还是“开关”控制，只能调控基因转录的开始和停止，即调节转录时间的长短而非转录强度的高低。而诱导物浓度效应往往只是增加群体中基因表达的细胞数而非各单个细胞的表达水平，不具体表达的均一性。此外，从实际工业应用的角度考虑，由于诱导物的价格一般较贵，且细胞对诱导物具有高度敏感性，其可操作性不强。正是由于这些缺陷，近些年来研究者开发了启动子文库(Promoter Library)用以作为对基因表达更为灵活和精确的调控工具。

启动子文库就是对调控基因转录的启动子碱基序列进行突变，通过报告基因(Reporter Gene，如绿色荧光蛋白GFP基因、半乳糖苷酶基因LacZ等)的表达水平，筛选得到的一系列不同强度的人工启动子集合体。由于启动子的碱基序列直接影响其调控基因转录的强度，故只要所构建的文库包含足够丰富的突变序列，筛选量足够大，就可以从中筛选出一系列具有不同调控强度的突变启动子，构成能对其下游基因实施“开量”式微调的文库。

启动子文库出现后即被应用于代谢工程的研究，并已在多方面显示了其强大的功能。首先，启动子文库实现了对基因表达“开量”式微调，显著优于利用单一启动子的“开关”式调控。Solem等人利用启动子文库，在乳酸乳球菌(Lactococculs latis)中，不仅对糖酵解途径pfk基因，还对位于同一操纵子内的另外两个基因(pyk和Idh)实现了强度递增的表达调控。其次，启动子文库可用于代谢分析，使人们能更准确地定位代谢控制节点。Keobmann等在大肠杆菌糖酵解途径的研究中，利用启动子文库调控F₁-ATP合成酶表达，发现逐渐提高ATP酶活水平和ATP的水解，可使糖酵解通量提高70％，表明糖酵解途径的主要调控因素是ATP水平，并非途径本身各反应的酶活。第三，启动子文库也可用于寻找多基因调控合成途径的限制性因素。Alper等在研究蕃茄红素的合成时，发现在野生菌中提高dxs基因(deoxy-xylulose-p synthase，脱氧-磷酸木酮糖合成酶)的表达，只能在一定程度上提高蕃茄红素的产量，而在过表达该合成途径下游两个酶的重组菌中，不断增强dxs基因表达能使蕃茄红素产量不断提高，说明脱氧-磷酸木酮糖合成酶活是重组菌合成途径的限制性因素。第四，启动子文库还可用于确定代谢控制的最优化基因调控水平。Nevoigt等在分析3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)基因GPD1对酿酒酵母甘油产率的影响时发现，通过突变启动子控制GPDH的酶比活变化不超过其野生型的2倍时，菌体的生物量和甘油产率均与GPDH活性正相关，但多拷贝基因的过表达，非但不能使甘油产率相应增加，还对细胞生长产生抑制，因此在代谢改造中可通过突变启动子文库来精确微调基因表达水平以达到最优化控制。

可见，通过构建启动子文库，将“开量”式微调基因表达成为可能，在代谢分析和改造中，突破了原来只能通过基因敲除(Knock out)和过表达(Over expression)两种非“开”即“关”的手段来实现对细胞基因型的扰动(Perturbation)，即可通过对目标基因表达进行梯度式的精确微调来分析和控制其对表型和代谢流分布的影响。此外，对这一工具的利用还可发展到使用文库中的不同启动子，对多个基因的表达同时进行调控。因此，启动子文库正在成为代谢工程研究向系统分析和整体优化发展中的有效研究工具，将极大地提升该领域的研究水平。

发明内容

本发明的目的在于提供用于毕赤酵母的GAP启动子文库及其用途。

本发明的另一目的在于提供筛选突变型GAP启动子的方法。