[发明专利]GAP启动子文库及其用途

权利要求书

1.一种突变型GAP启动子文库，其特征在于，所述的启动子文库包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的启动子。

2.如权利要求1所述的启动子文库，其特征在于，所述的SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的启动子具有依次减弱的启动目的基因表达的强度。

3.如权利要求1所述的启动子文库，其特征在于，所述的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的启动子相对于野生型GAP启动子是增强型GAP启动子；所述的SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的启动子相对于野生型GAP启动子是弱化型GAP启动子。

4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，作为启动子元件。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞：

含有权利要求4所述的载体；或

其基因组中整合有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的核酸。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是毕赤酵母(PichiaPastoris)细胞。

7.权利要求1所述的突变型GAP启动子文库的用途，其特征在于，用于提供突变型GAP启动子，将所述突变型GAP启动子可操作性地与目的基因连接，调节目的基因的表达。

8.一种筛选突变型GAP启动子的方法，所述的突变型GAP启动子相对于野生型GAP启动子、启动目的基因表达的强度发生变化，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供重组表达载体1，所述重组表达载体1含有GAP启动子突变体序列，以及与所述GAP启动子突变体序列操作性相连的报告基因序列；将该重组表达载体1转化宿主细胞，获得重组宿主细胞1，用BMD培养基培养该重组宿主细胞1；

(2)提供重组表达载体2，所述重组表达载体2含有野生型GAP启动子序列，以及与所述野生型GAP启动子序列操作性相连的报告基因序列；将该重组表达载体2转化宿主细胞，获得重组宿主细胞2，用BMD培养基培养该重组宿主细胞2；

(3)观察所述的重组宿主细胞1表达报告基因的情况，若相对于重组宿主细胞2，重组宿主细胞1报告基因的表达强度发生变化，则该重组宿主细胞1中重组表达载体1携带的GAP启动子突变体为所需的突变型GAP启动子。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)或(2)中，用BMD培养基培养重组宿主细胞的方法包括：

(a)用BMD培养基A预培养该重组宿主细胞30-50小时；其中，所述的BMD培养基A中葡萄糖浓度0.2±0.05％；

(b)将经预培养的重组宿主细胞转移到BMD培养基B，培养30-65小时；其中，所述的BMD培养基B中葡萄糖浓度1±0.2％。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的报告基因是绿色荧光蛋白，且步骤(2)中，观察所述的重组宿主细胞表达报告基因的情况的方法包括：测定含有所述的重组宿主细胞的培养基的荧光强度。