[发明专利]一种抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及卵黄免疫球蛋白，具体涉及抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法。

背景技术

鸡卵黄免疫球蛋白G抗体是一种7S免疫球蛋白，与哺乳动物IgG略有不同。该蛋白质分子量约为180kDa，含两个亚单位，即67～70kDa的重链和22～30kDa的轻链，又称IgY(Yolk Immunoglobulin)，存在于免疫后母鸡的卵黄中。实验证明，受免疫刺激后，母鸡产生免疫反应，在输卵管内卵黄成熟期，血液中IgG可被选择性地转移到卵黄中，而且是卵黄中唯一的免疫球蛋白类。早在60年代，科学家们就发现鸡卵黄中存在IgG抗体，其含量与鸡血清相似甚至更高，但一直未引起足够的重视。显然是由于很难将IgG抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。直到80年代初，科研人员相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇(PEG)提取法和硫酸葡聚糖提取法，有关这方面的研究便如雨后春笋般大量涌现，并且被广泛应用在生物学的许多领域。

卵黄作为特异抗体IgY的来源有许多优点。如：母鸡易于饲养，费用不高；收集鸡蛋方便，无需抽动物血，无损伤，符合现代动物保护规则；产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。因此，IgY在免疫学检测方面正在受到愈来愈广泛的应用。在免疫治疗方面，因鸡抗体耐酸、耐热且性能稳定，可经口服用于预防或治疗年幼动物或人类的肠道传染病，如婴儿防病食品等。特别是抗生素或其它药物的使用存在问题时，IgY成为首选。

引起人类腹泻的病原体主要是人轮状病毒和大肠埃希氏杆菌。人轮状病毒(HRV)是新生婴儿胃肠道感染并引起呕吐、腹泻的最主要原因之一。如果处理不当常导致死亡。据估计，发展中国家每年有数百万婴幼儿因此而死亡。大肠埃希氏杆菌(E.coli)引起的腹泻占腹泻发病病例的30％以上。引起腹泻的大肠埃希氏杆菌分致病性、产肠毒素性和侵袭性等多种。

目前已见报道的有关抗腹泻卵黄免疫球蛋白(IgY)的研究，其IgY都是单价的，抗腹泻的功能比较单一，抗腹泻的范围比较狭窄。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种成本低、产量高、应用范围广的抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)蛋鸡的免疫：运用免疫学方法，将大肠埃希氏杆菌和人轮状病毒制成疫苗后同时对蛋鸡进行免疫，均可在鸡血清和蛋黄中产生高效价的抗体，并维持35-50天左右不发生较大幅度的降低，当鸡蛋中抗体效价出现较大程度的降低时，通过追加免疫使其效价恢复到接近最高水平，且可持续50天左右，收集鸡蛋制备具有抗腹泻功能的多价卵黄免疫球蛋白；

(2)抗腹泻多价卵黄免疫球蛋白分离提纯：采用水稀释法将步骤(1)收集的鸡蛋的蛋黄进行脱脂处理，得到抗腹泻功能的多价卵黄免疫球蛋白溶液，将该溶液用5千膜浓缩4-8倍，然后在硫酸铵饱和度45-50％，pH值6.0-7.0的条件下盐析，将沉淀溶解后先后用5万膜和5千膜超滤，将盐析和超滤处理的产品经层析处理进一步纯化即得产品。

所述的步骤(1)中蛋鸡的免疫时间为：

(1)基础免疫：19周龄蛋鸡，1ml/羽接种，

(2)第一次加强免疫：基础免疫后14天，1.5ml/羽接种，

(3)第二次加强免疫：基础免疫后35天，1.5ml/羽接种，

(4)第一次追加免疫：基础免疫后112天，1.5ml/羽接种，

(5)第二次追加免疫：基础免疫后175天，1.5ml/羽接种。

所述的步骤(2)中的水稀释法是在蛋黄中加入水进行稀释浸提，然后进行离心分离脱脂，脱脂条件为：稀释倍数为8-10倍，pH值为5-6，浸提2小时，离心条件为5000rpm，30min。

所述的步骤(2)中的层析处理是采用SephadexG-200柱进行层析处理。

本发明把几种引起人体腹泻的细菌和病毒制成疫苗后接种于蛋鸡，使这些蛋鸡所下的鸡蛋中含有具有抗腹泻功能的抗体，然后再从鸡蛋中提炼这种多价卵黄抗体，把它制成口服液或添加到食品和饮料中，用以防治病菌性腹泻。本发明的特点是将HRV和E.coli灭活苗同时对蛋鸡进行免疫，使其所产的蛋中同时含有抗HRV和E.coli的抗体，从这些鸡蛋中提取的IgY为多价抗体，它的功能多，抗腹泻范围广。同时我们对IgY的稳定性进行改进，以保证其功能的发挥及保存。