[发明专利]利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法有效
| 申请号： | 200910052722.0 | 申请日： | 2009-06-09 |
| 公开（公告）号： | CN101565739A | 公开（公告）日： | 2009-10-28 |
| 发明（设计）人： | 朱利民;苏赛男;聂华丽 | 申请（专利权）人： | 东华大学 |
| 主分类号： | C12Q1/37 | 分类号： | C12Q1/37;G01N30/02 |
| 代理公司： | 上海泰能知识产权代理事务所 | 代理人： | 黄志达;谢文凯 |
| 地址： | 201620上海市松*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 利用 快速 蛋白质 色谱 测定 木瓜蛋白酶 纯度 方法 | ||
1.一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法，包括：
（1）配制流动相
流动相A溶液：0.02~0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；
流动相B溶液：含1.0~2.0mol/L氯化钠的0.02~0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；
（2）制备对照品溶液
将精制木瓜蛋白酶置入50ml容量瓶内，加入流动相A溶液至50ml刻度线定容，摇匀， 至精制木瓜蛋白酶充分溶解，制得精制木瓜蛋白酶对照品溶液；
（3）制备供试样品溶液
将粗制木瓜粉置于50ml容量瓶中，加入流动相A溶液至50ml刻度线定容，摇匀，经滤纸 过滤，备用；
（4）利用快速蛋白质液相色谱FPLC的离子交换色谱柱进行层析分离，通过计算峰面积 比值的公式：X=（粗制木瓜蛋白酶的峰面积×精制木瓜蛋白酶的浓度）/（精制木瓜蛋白酶的 峰面积×粗制木瓜蛋白酶的浓度）×100%，来计算木瓜蛋白酶的纯度；其中色谱条件是离子 交换柱为HiTrapTM SPXL1ml，流动相A溶液为0.02~0.1mol/L pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶 液，流动相B溶液为含1.0~2.0mol/L氯化钠的0.02~0.1mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液， 上样量为250~500μl，平衡为5~10个柱床，冲洗为5~7个柱床，洗脱梯度为流动相B溶液在 15~25个柱床内由0%线性增加至70%-100%，流速为0.8~1.0ml/min。
2.根据权利要求1所述的一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法，其特征 在于：所述步骤（1）中的流动相A溶液为0.05mol/LpH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法，其特征 在于：所述步骤（1）中的流动相B溶液为含2.0mol/L氯化钠的0.05mol/L pH4.5的乙酸- 乙酸钠缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法，其特征 在于：所述步骤（2）中的木瓜蛋白酶的用量为250mg-500mg。
5.根据权利要求1所述的一种利用快速蛋白质液相色谱测定木瓜蛋白酶纯度的方法，其特征 在于：所述步骤（3）中的粗制木瓜蛋白酶的用量为300mg-500mg。
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