[发明专利]一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法

说明书

技术领域

本发明属铁皮石斛胚芽干品的制备领域，特别是涉及一种无激素规模化培养生产铁皮 石斛胚芽干品的方法。

背景技术

石斛作为传统名贵中药材历来受医学界的重视，由于它的特殊疗效功能，受到医学家 的推崇。石斛对生产环境条件较为苛刻，生长缓慢，生物产量极为低下，加上人们长期无 节制采挖，生态环境的恶化，使整个药用石斛类植物面临濒灭境地，其中尤以铁皮石斛， 又名霍山石斛(中药大辞典1985)为优。

对于铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)胚芽干品，迄今为止尚未见无 激素规模化培养生产的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的 方法，该方法步骤简单，生产周期时间短，成本低，对环境友好，适合工业化生产，解决 了铁皮石斛资源短缺的问题。

本发明的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，包括：

(1)外植体的培养和接种

将铁皮石斛原种植株培养成3-5cm高，带3-5片叶，具3-4节间的成年株，采集外植 体用自来水反复冲洗至无泡沫为止，然后将其灭菌，切去全叶和植物基部0.3～0.6cm，接 种到M2固体培养基，于暗培养条件下，24℃±1℃，诱导休眠芽的生长35～45天；

(2)胚状体的继代增殖

将休眠芽诱导成功后，移到光培条件下2000Lx，16～20小时光照，长到0.8～1.2cm时 剥离休眠芽，移入到M2液体培养基(去掉固体中的琼脂粉)中，每7天继代一次，24℃ ±1℃，自然室内光强度，经45-50天后，诱导出胚状体；

(3)无激素一级培养及筛选

取上述胚状体接种到M2液体培养基中，进行一级液体扩大培养，每10天继代一次， 每次继代按1∶2扩大群体，经3-5个周期后，挑选形态生长正常、绿色、外形大小相近 的培养系，用M0液体培养基，每10天继代一次，进行5～8次的继代培养，得成熟细胞系；

(4)无激素二级通气培养

将上述成熟细胞系接种到M0液体培养基，并加入一级培养后的条件培养基(原母瓶 的老培养基)，进行二级通气扩大培养，每天提供14-16小时光照或采取太阳自然光，培养 15～20天；

(5)无激素终极通气培养

选择20升培养容器，每个容器装液量为16升，其中14升为新鲜的M0液体培养基， 2升为步骤(4)培养时的条件培养基(原母瓶的老培养基)，选择步骤(4)得到的种子进 行接种，保持2000-2500Lx光强度，按38-40度斜面于专制培养架上培养15～20天，收集 鲜品；

(6)鲜成品的后处理

将上述鲜品收集后，用纯净水冲洗一遍后漓干、称重，然后于50～60℃干燥，按250g、 500g、1000g或5000g定量包装，经α射线灭菌后，8℃-12℃保存。

步骤(1)中所述的M2固体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机 成分+蔗糖30g/L+CH(水解酪蛋白)500mg/L+萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素 BA0.2mg/L+100g香蕉汁+琼脂粉4.8g/L，PH5.8，常规灭菌；

步骤(1)中所述的灭菌为50％乙醇浸润3-5秒→20％“84”液7-8分钟→0.1％升汞液 中12-15分钟→灭菌水冲洗几遍后，吸干水分；

步骤(2)和(3)中所述的M2液体培养基为1/2MS大量之素+全量铁盐+全量微量+ 全量有机成分+蔗糖30g/L+CH(水解酪蛋白)500mg/L+萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素 BA0.2mg/L，PH5.8，常规灭菌；

步骤(4)中所述的M0液体培养基为1/2MS大量之素+全量铁盐+全量微量+全量有机 成分+蔗糖30g/L，PH5.8，常规灭菌；

步骤(4)中所述的条件培养基为石斛在步骤(3)中的M0液体培养基中培养10～15 天后的老培养基；

步骤(5)中所述的条件培养基为石斛在步骤(4)中的M0液体培养基中培养10～15 天后的老培养基；

步骤(5)中所述的专制培养架为每个架子占地1M²，装三层，一排3个20L容器， 每个架子放置18个。