[发明专利]一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法

权利要求书

1.一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，包括：

(1)外植体的培养和接种

将铁皮石斛原种植株培养成3-5cm高，带3-5片叶，具3-4节间的成年株，采集外植 体用自来水反复冲洗至无泡沫为止，然后将其灭菌，切去全叶和植物基部0.3～0.6cm，接 种到M2固体培养基，于暗培养条件下，24℃±1℃，诱导休眠芽的生长35～45天；其中 M2固体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机常规+蔗糖30g/L+水解酪 蛋白CH 500mg/L+α-萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁/L+琼脂 粉4.8g/L，PH5.8，常规灭菌；

(2)胚状体的继代增殖

将休眠芽诱导成功后，移到光培条件下2000Lx，16～20小时光照，长到0.8～1.2cm时 剥离休眠芽，移入到M2液体培养基，每7天继代一次，24℃±1℃，自然室内光强度，经 45-50天后，诱导出胚状体；其中M2液体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+ 全量有机常规+蔗糖30g/L+水解酪蛋白CH500mg/L+α-萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素 BA0.2mg/L+100g香蕉汁/L，PH5.8，常规灭菌；

(3)无激素一级培养及筛选

取上述胚状体接种到M2液体培养基，进行一级液体扩大培养，每10天继代一次，每 次继代按1∶2扩大群体，经3-5个周期后，挑选形态生长正常、绿色、外形大小相近的 培养系，用M0液体培养基，每10天继代一次，进行5～8次的继代培养，得成熟细胞系； 其中M2液体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机常规+蔗糖30g/L+ 水解酪蛋白CH500mg/L+α-萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁/L， PH5.8，常规灭菌；

(4)无激素二级通气培养

将上述成熟细胞系接种到M0液体培养基进行二级通气扩大培养，并加入一级培养后 的条件培养基，每天提供14-16小时光照或采取太阳自然光，培养15～20天；其中M0液 体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机常规+蔗糖30g/L，PH5.8，常 规灭菌；

(5)无激素终极通气培养

选择培养容器，每个容器装液量为16升，其中14升为新鲜的M0液体培养基，2升 为步骤(4)培养时的条件培养基，选择步骤(4)得到的种子进行接种，保持2000-2500Lx 光强度，按38-40度斜面于专制培养架上培养15～20天，收集鲜品；

(6)鲜成品的后处理

将上述鲜品收集后，用纯净水冲洗一遍后漓干、称重，然后于50～60℃干燥，按250g、 500g、1000g或5000g定量包装，经γ射线灭菌后，8℃-12℃保存。

2.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在 于：步骤(1)中所述的灭菌为50％乙醇浸润3-5秒，然后用20％“84”液浸润7-8分钟， 0.1％升汞液浸润12-15分钟，最后用灭菌水冲洗几遍后，吸干水分。

3.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在 于：步骤(4)中所述的条件培养基为石斛在步骤(3)中的M0液体培养基中培养10～15 天后的老培养基。

4.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在 于：步骤(5)中所述的条件培养基为石斛在步骤(4)中的M0液体培养基中培养10～15 天后的老培养基。

5.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在 于：步骤(5)中所述的专制培养架为每个架子占地1M²，装三层，一排3个20L容器， 每个架子放置18个。