[发明专利]黄芪均多糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药技术领域的制备方法，特别涉及一种黄芪均多糖的制备方法。

背景技术

多糖是一类天然高分子化合物，是由醛糖或酮糖通过甙键连接在一起的多聚物。自上世纪70年代发现多糖及糖复合物参与细胞的各种生命现象的调节以来，人们不断发现多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血等多种生物活性。并且由于多糖没有明显的毒副作用，对多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。

黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.或蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge)Hsiao的干燥根，素以“补气诸药之最”著称，是一种常用的扶正中药。性味甘、微温，归脾、肺经，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。黄芪含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、苷类、微量元素等多种生物活性物质，其中黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是黄芪主要的生物活性成分之一，具有免疫调节、降血糖、抗肿瘤、促进骨髓造血干细胞增殖和双向调节血糖等作用。

经对现有技术的文献检索发现，中国专利CN101020721A公布了一种制备高纯度粗黄芪多糖的方法，恒温微波提取后离心，上清液活性炭脱色，醇沉，凝胶过滤层析即得；中国专利CN101029086A则公布了一种联合应用微波提取、微滤、超滤和醇沉技术来制备黄芪多糖的方法。尚未进一步发现分子量明确、多糖组成清楚的黄芪均多糖制备方法的公开文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种黄芪均多糖的制备方法。本发明的方法得到的多糖平均分子量约为9000，完全酸水解后只含有葡萄糖一种单糖单元；本发明的方法简单快速，成本低廉。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

步骤一，取黄芪粗粉，用3倍量体积分数的乙醇回流脱脂1.5h，其中乙醇为体积分数为95％的乙醇；过滤，药渣中加入为药渣6～12倍量体积分数的水回流提取90min，过滤，重复提取2次，合并滤液；

步骤二，取滤液，浓缩至滤液体积的1/5～1/10，得到浓缩液，在浓缩液中加入体积分数为95％的乙醇，搅拌，直至溶液中的乙醇的体积分数为50％～80％，沉淀，静置过夜，离心或过滤，收集沉淀物，洗涤，60℃真空干燥，即得黄芪粗多糖；

步骤三，利用步骤二得到的黄芪粗多糖制备20g·L^-1的黄芪粗多糖水溶液，按照黄芪粗多糖与胃蛋白酶的摩尔比为1∶1～1∶5的比例向黄芪粗多糖水溶液中加入胃蛋白酶，37℃下酶解3～7小时，煮沸10min，离心，得到上清液；

步骤四，按上清液与Sevage试剂体积比为4∶1～6∶1的比例，在上清液中加入Sevage试剂，其中Sevage试剂具体为：氯仿与正丁醇按体积比为4∶1配制而成；振摇萃取，离心并收集上层水相溶液，重复操作3～6次；

步骤五，在步骤四得到的水相溶液中加入二乙氨基乙基纤维素，使二乙氨基乙基在水相溶液中的重量百分比为0.5％～1.5％，煮沸10～20min，过滤，得到滤液，将滤液浓缩至步骤三中的黄芪粗多糖水溶液体积的1/10，浓缩液用截流分子量为3000的透析袋进行透析，透析3d，在透析后的溶液中加入体积分数为95％的乙醇，直至溶液中乙醇的体积分数为80％，沉淀，静置过夜，离心或过滤，收集沉淀物，洗涤，60℃真空干燥，即得精制黄芪多糖；

步骤六，取精制黄芪多糖，超声水溶解，二乙氨基乙基弱阴性离子交换柱层析分离，去离子水洗脱，流速为0.8～1.2mL·min^-1，苯酚硫酸法检测，合并490nm处有吸收的部分，浓缩，冷冻干燥，得到白色固体物；

步骤七，将步骤六中得到的白色固体物加水溶解，经凝胶柱层析纯化分离，去离子水洗脱，流速为8～10mL·h^-1，HPLC-ELSD监测，根据液相图谱合并保留时间最长的对称峰部分，浓缩，冷冻干燥，即得黄芪均多糖。

步骤二和步骤五中，所述洗涤为，先用无水乙醇洗一次，再用丙酮洗一次，重复两次。

步骤三中，所述胃蛋白酶酶活力≥1200U/g。

所述柱层析用水为去离子水。