[发明专利]一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素的方法，属于生物医疗技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)已经成为最常见的神经变性性疾病，给个人、家庭和社会产生严重的危害。迄今为止，晚发性(散发性)AD的发病机理仍然没有得到完全解析，大量的研究形成了很多假说，也发现了一些被认为与AD发病相关的生物靶标，这些生物靶标虽然大多与β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)和tau蛋白代谢有关，但并未能发展成特异性的诊断标志和有效的治疗措施。目前临床使用脑内胆碱酯酶抑制剂(如石杉碱甲和多奈哌齐等)和非竞争性NMDA受体拮抗剂(美金刚)并不能阻止AD病情的进展。被认为最有前景的β-淀粉样蛋白疫苗治疗尽管确实有清除脑内β-淀粉样蛋白斑的作用，但不能抑制痴呆症状的发展。所以不得不从更为广泛的视角重新思考晚发性AD发病的可能病理机制及其防治策略。

研究发现，AD患者和动物模型脑细胞糖与能量代谢显著降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成，糖代谢障碍已被认为是AD的独立危险因素，部分学者甚至建议将AD归类为III型糖尿病。

进一步研究发现，在AD患者，与脑细胞糖和能量代谢障碍有关的酶活性异常中，仅以硫胺素(维生素B1)作为辅酶的α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，KGDH)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)和转酮醇酶(transketolase，TK)等活性下降最为明显。由于KGDH、PDH和TK分别为机体葡萄糖代谢仅有的两条通路——葡萄糖氧化脱羧-三羧酸循环和磷酸戊糖代谢旁路的关键酶，其活性下降将严重损害细胞糖和能量代谢、神经递质和细胞代谢必备物质合成功能(如乙酰胆碱、乙酰辅酶A、NDAH、NADPH、5-磷酸核糖等)等，并导致氧化应激等病理生理学变化。因此，引起以硫胺素为辅酶的蛋白酶机能性抑制导致细胞糖代谢组学异常和能量代谢障碍与AD的发生发展可能密切相关。

AD患者体内PDH、KGDH和TK酶活性下降显然难以用这三个蛋白酶相关的基因同时变异等分子生物学机制来解释。由于硫胺素是这三个酶的辅酶，而慢性硫胺素缺乏(如慢性酗酒)导致的病理学损害特征与AD惊人地相似：如脑区选择性神经元丢失、海马及其邻近脑区tau蛋白异常磷酸化、Aβ分泌增多和异常沉积等，硫胺素缺乏加重APP/PS1转基因小鼠易损脑区氧化应激的同时，也显著增加Aβ沉积。因而，硫胺素缺乏或机能抑制才可能是AD患者PDH、KGDH和TK活性下降的真正原因。

硫胺素缺乏在AD人群中是一个非常普遍的现象，而且几乎所有硫胺素代谢环节均出现异常：不仅血和脑组织中游离硫胺素含量下降25％、单磷酸硫胺素下降33-45％、焦磷酸硫胺素下降28-40％，而且硫胺素单磷酸酶(下降31-64％)和硫胺素焦磷酸酶(下降28-62％)等活性也显著下降。Gold等人的研究发现，血硫胺素水平降低与晚发性AD发病有关，而与帕金森病无关。这提示机体硫胺素缺乏与AD的关联具有一定的特异性。但问题是：(1)在并无饮食缺乏或限制的情况下，为什么这些患者体内硫胺素会显著缺乏？(2)除上述三个硫胺素作为辅酶的活性下降以外，为什么AD患者体内几乎所有硫胺素代谢环节均出现异常？(3)补充水溶性硫胺素为什么并不能阻止AD的发生和发展呢？上述问题显然难以用单纯的饮食缺乏硫胺素来解释。

发明内容

本发明的目的是确定一种用于阿尔茨海默病诊断和治疗的有效靶标，提供一种检测其在血液中含量的方法。

为了实现上述目的，本发明设定AD患者体内可能存在硫胺素拮抗性物质抑制了机体硫胺素吸收和代谢功能。硫胺素拮抗性物质竞争性地抑制了机体硫胺素吸收和代谢功能。由于硫胺素在体内依靠硫胺素转运蛋白主动转运，竞争结合力强的拮抗性物质存在可能抑制机体对硫胺素的吸收和代谢，导致并无饮食缺乏或限制硫胺素的AD患者机体内硫胺素代谢全面异常，即使补充超大剂量(如2克/日)结合力较弱的硫胺素也无法改变AD患者硫胺素缺乏的状态。

基于上述假设，本发明进行了探索性的预实验研究并在AD患者血中发现了作用超强的硫胺素拮抗性物质并确定其为吡啶硫胺素，其分子式：C₁₄H₂₀N₄O；分子量约为260，分子结构如下：