[发明专利]一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素的方法

权利要求书

1.一种高效液相色谱检测血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将血液在-80℃保存；将铁氰化钾加入到150g/L氢氧化钠溶液中配制0.25g/L铁氰化钾溶液；将吡啶硫胺素加入到0.1M盐酸溶液中配制0.1mM吡啶硫胺素溶液，4℃避光冷藏，测定当日用重量浓度为20％的甲醇溶液稀释配制吡啶硫胺素标准溶液，其浓度为Cs；将磷酸氢二钠加入到重量浓度为10％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氢二钠溶液；将磷酸二氢钠加入到重量浓度为70％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氢钠溶液；

第二步：将第一步所得吡啶硫胺素溶液与铁氰化钾溶液以体积比25∶3混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到标准溶液，高效液相色谱检测得到吡啶硫胺素的流出时间及其对应的峰面积As，色谱条件为：使用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，分别以第一步所得磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液为第一流动相和第二流动相，以流速1.0mL/min梯度洗脱，荧光检测激发波长为385nm、发射波长为460nm；所述第二步中梯度洗脱流程为：流出时间为0min时全部为第一流动相，逐渐增加第二流动相的比例，流出时间为1.5min时第一流动相和第二流动相的体积比为7∶1，流出时间为4min时第一流动相和第二流动相的体积比为1∶1，流出时间为6min时全部为第二流动相；

第三步：将血液样本避光解冻后，预处理除去蛋白质，以体积比25∶3与第一步所得铁氰化钾溶液混合，以0.2um孔径过滤膜过滤得到样品溶液，采用与第二步相同的色谱条件检测样品溶液，得到与吡啶硫胺素的流出时间对应的峰面积Ai，按下式计算血液中吡啶硫胺素的浓度Ci：

Ci＝Cs·(Ai/As)。

2.如权利要求1所述的检测血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，所述第三步中将血液预处理除去蛋白质的具体步骤为：在血液样本中加入等体积的乙腈，振荡15s，以转速15000rpm离心15min，取上清液以转速15000rpm再次离心15min，取上清液常温旋转蒸干，用重量浓度为20％的甲醇溶液滴定至血液样本相同体积。

3.如权利要求1所述的检测血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，所述第三步中将血液预处理除去蛋白质的具体步骤为：在血液样本中加入等体积的重量浓度为10％的三氯乙酸溶液，振荡15s，以转速13000rpm离心5min，取上清液以转速13000rpm再次离心5min，取上清液加入水饱和甲基叔丁基醚洗涤，取下层溶液，重复洗涤一次，取下层溶液。