[发明专利]一种测定血清中药物活性成分的方法

权利要求书

1.一种测定血清中药物活性成分的方法，其特征是采用高效液相色谱-质谱联用的方法，分析给药后血清、空白血清及药物的提取液，测定药物活性成分及药物活性成分的含量；包括以下步骤：

(1)配制药物提取液：

取药物粉末，用混合溶剂超声提取后12000r/min离心，过滤，得药物提取液；

(2)制备空白血清样品：

羧甲基纤维素钠用纯水制成混悬液，动物灌胃给药后，取静脉血，置涂肝素钠的EP管中，离心，沉淀蛋白后，上清液真空旋转蒸干，得空白血清样品；

(3)制备给药后血清样品：药物碎成细粉后，用0.5％的羧甲基纤维素钠制成混悬液，药物的浓度为0.34g/ml，SD大鼠给予药物混悬液灌服3.4g/kg大鼠体重，服药0.5-3小时后，大鼠腹腔注射1％的戊巴比妥钠溶液麻醉，0.15ml/kg大鼠体重，取静脉血，置涂肝素钠的EP管中，4℃条件下，3000r/min离心10min；取上清液400μl，加入5ml EP管中，沉淀蛋白，涡旋1min，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200μl甲醇复溶，离心；上清液即给药后血清样品；

(4)高效液相色谱-质谱联用分析：

色谱柱：Waters Symmetry C₁₈色谱柱，5μm，250mm×4.6mm；流动相为甲醇-水系统、乙腈-水系统、乙腈-0.5％乙酸水溶液或乙腈-0.5％甲酸水溶液；流速0.8mL/min；柱温25℃；电喷雾离子化源ESI，源电压3.5kv；干燥气流速10L/min；干燥气温度350℃；喷雾气压力30psi；MS/MS打碎电压1.0V，扫描的范围为100-1500u，分别采集正离子和负离子模式下的MS和MS/MS图谱；

(5)比较给药血清和空白血清的质谱图，扣除空白血清中的内源性成分，得给药后血清中的差异性成分，即所测得的药物的活性成分。

2.按权利要求1所述的测定血清中药物活性成分的方法，其特征是所述药物为治疗心血管疾病的复方中药。

3.按权利要求1所述的测定血清中药物活性成分的方法，其特征是所述药物为麝香保心丸，国药准字Z31020068，主要含含下述原料药组分：麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤1的混合溶剂为甲醇∶二氯甲烷∶水＝4∶2∶0.5，V/V，超声时间为20min。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征是，所述方法中，制备空白或给药血清样品，采用灌胃后2小时从肝门静脉取血，每400μl血清用甲醇3ml沉淀蛋白；流动相为乙腈：0.5％甲酸水溶液。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征是，所述的步骤5)的差异性成分以下述16个共有色谱峰的保留时间Rt值、分子量、一级质谱离子数据和二级质谱离子数据表示：

7.按照权利要求6所述的方法，其特征是：产生的所述的药物的活性成分，分别为：日本蟾蜍它灵，人参皂苷Re，1β-羟基蟾毒灵，人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra1，脂蟾毒精醇，人参皂苷Rc，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb3，人参皂苷Rd，蟾毒灵，胆酸，猪去氧胆酸，华蟾酥毒基，鹅去氧胆酸，去氧胆酸。