[发明专利]一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明属生化分析领域，涉及一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法。具体 涉及一种利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE)作为电泳支持介质分离大 分子量蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质组是研究发现临床重大疾病的生物靶标的一个有力的工具。目前，蛋白质 组研究正日益受到国内外科研工作者的密切关注。时间显示，为了减少实际样品的复 杂性，蛋白质的分离是至关重要的。现有技术公开了大规模的蛋白质分离主要依赖于 凝胶电泳技术和液相色谱技术。前者由于其成熟的技术和良好的分离能力，仍是当今 分离复杂蛋白质样品的首选，并得到生物质谱的技术支持得以大规模分析鉴定。但是 低丰度蛋白、极酸极碱性区蛋白、高分子量蛋白和疏水性蛋白等的分析和鉴定仍是蛋 白质组学研究的重点和难点内容。其中，大分子量蛋白质(分子量大于100kDa)由于 其和很多重大疾病相关，如迪谢纳-贝克肌肉萎缩症、原发性心肌炎等，越来越受到重 视。一般分离采用的聚丙烯酰胺水凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯 酰胺通过化学催化剂(过硫酸铵)，四甲基乙二胺(TEMED)作为加速剂催化聚合作用 形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、 电荷效应、分子筛效应，通过蛋白质的分子量差异对蛋白进行分离。但是，分离大分 子量蛋白所需要的聚丙烯酰胺凝胶单体浓度太低(小于5％w/v)，这样的聚丙烯酰胺凝 胶易碎，不易于操作。因此很多学者将另一种水凝胶——琼脂糖凝胶引入蛋白质分离 系统中，以期具有相对大孔径且机械强度较大的琼脂糖凝胶可以实现大分子蛋白的分 离。但是无论是将琼脂糖胶作为等电聚焦介质还是分子筛作用的垂直电泳介质，都面 临了很多问题，包括其凝固点高不利于室温操作和胶的重现性，染色方法与质谱鉴定 不兼容等。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术大分子量蛋白分离分析困难的问题，提供一种分离 富集和鉴定大分子量蛋白质的方法。本发明以水凝胶作为电泳支持介质，尤其是利用 低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE)作为电泳支持介质分离大分子量蛋白 质。

本发明所述的新型凝胶是一种低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺的混合凝胶，其特点在 于既具有琼脂糖凝胶平均孔径大、分辨率高、机械强度好的特点，又具有聚丙烯酰胺 凝胶质谱兼容型的特点，最重要的是采用了低熔点琼脂糖代替普通琼脂糖，熔点和凝 固点都大大低于普通琼脂糖，便于操作和充分混匀，适用于普通薄板垂直电泳，可形 成均一的、重现性好的混合凝胶。

本发明中，联和应用新型凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离-电喷雾质谱鉴定的 分析路线(AgPAGE-LC-ESI-MS/MS)和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合新型凝胶垂直 电泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线(IEF-AgPAGE-MALDI-MS)。

所述MALDI-MS鉴定的路线中，采用纳米核壳复合材料对酶解的蛋白进行快速、高 效富集除盐，使得大分子量蛋白质的鉴定率大大提高。。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1.采用低熔点琼脂糖(凝固点接近或低于室温)和聚丙烯酰胺混合凝胶(AgPAGE) 作为电泳支持介质来分离分子量大于100kDa的蛋白质。

2.根据低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺两个组分的不同比例调整合适的大分子量分离 范围。

3.利用与质谱兼容的银染方法进行蛋白质显色且进行胶内酶解提肽。

4.ESI-MS鉴定路线中，先用新型凝胶将大分子量蛋白从其他蛋白中得到初分离， 酶解后的肽段再进入LC分离，简化了分离体系。

5.MALDI-MS鉴定的路线中，采用纳米核壳复合材料对酶解的蛋白进行快速、高效 富集除盐。

本发明中，通过下述方法制备低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶：

低熔点琼脂糖(凝固点接近或低于室温)溶于含有pH 7～9的缓冲溶液中，在高于 熔点的水浴中充分溶解，然后冷却至室温，制成低熔点琼脂糖溶液；另一方面，制备 低浓度的丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺交联剂的质量比范围为25～40，然 后将以上两种溶液按照丙烯酰胺与低熔点琼脂糖的质量比在35～2的范围内混合，再加 入TEMED加速催化剂，倒入垂直电泳玻璃板槽，引发自由基聚合反应，形成均匀的薄 板凝胶。