[发明专利]一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法

权利要求书

1.一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是利用低熔点琼脂糖和聚 丙烯酰胺混合凝胶作为电泳支持介质，联和应用所述凝胶垂直电泳结合高效液相色谱 分离-电喷雾质谱鉴定的分析路线和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合所述凝胶垂直电 泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线，分离大分子量蛋白质，其包括下 述步骤：

1)通过下述步骤制备低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶：

(1)低熔点琼脂糖溶于含有pH 7～9的缓冲溶液中，在高于熔点的水浴中充分溶 解后，冷却至室温，制成低熔点琼脂糖溶液，其中低熔点琼脂糖凝固点接近或低于室 温；

(2)制备低浓度的丙烯酰胺溶液，其中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺交联剂的质量比 范围为25～40；

(3)将以上两种溶液混合，其中丙烯酰胺与低熔点琼脂糖的质量比为35～2，再 加入TEMED加速催化剂，倒入垂直电泳玻璃板槽，引发自由基聚合反应，形成均匀的 薄板凝胶；

2)采用质谱兼容的染色；

3)采用上述混合凝胶垂直电泳将大分子量蛋白从全蛋白中分离出来后，酶解肽段 进入LC分离体系分离，进行ESI-MS鉴定；

4)采用纳米核壳复合材料对二维凝胶电泳后胶粒酶解的单个大分子量蛋白点进行

快速、高效富集除盐，实现离线富集除盐，然后进入MALDI-MS质谱分析。

2.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的 纳米核壳复合材料为含有无机纳米内核的聚甲基丙烯酸甲酯微球，直径为100～500纳 米。

3.按权利要求2所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的 纳米核壳复合材料加入多肽或蛋白质样品的溶液富集，富集时间为10-12分钟，富集 温度为25-37摄氏度，离心除上清，与基质均匀混合，形成结晶，进行基质辅助激光 解析离子化质谱分析。

4.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述质 谱兼容的染色为考马斯亮蓝染色或硝酸银染色法，染色过程中无需干胶步骤。

5.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的 聚丙烯酰胺和低熔点琼脂糖在35～2的质量比范围内调整大分子量分离范围。

6.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的 低熔点琼脂糖粉末的溶解体系是PH 7～9的缓冲溶液体系。

7.按权利要求1所述的分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，其特征是所述的 低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶电泳使用的平板垂直电泳体系。