[发明专利]一种检测氯霉素的酶联免疫试剂及方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测分析技术领域中的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂及方法。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是第一个采用化学合成法生产的抗生素，对多种病原菌具有较强的抑制作用。由于其效高价廉，曾被广泛应用于各类家禽、家畜、蜜蜂和水产品的各种传染病的防治。然而，氯霉素存在着严重的毒副作用，能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺症以及新生儿、早产儿灰色综合症等，对人类健康构成巨大的潜在威胁。因此，氯霉素残留问题已引起国际组织和许多国家及地区的高度重视。欧盟、美国等发达国家已相继禁止氯霉素用于动物源性食品，并明确规定氯霉素残留限量为不得检出。

目前国内外的氯霉素检测技术方法主要有微生物法、放射免疫法、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、质谱分析等，这些方法各有优劣，而酶联免疫法(ELISA)具有特异性强、灵敏度高，样品预处理简单，检测时间短、检测样本量大等优点。

发明内容

本发明的检测原理：当包被原为氯霉素偶联抗原时是将氯霉素半抗原与牛丙种球蛋白偶联物(CAP-BGG)吸附于固相载体上，加入样本或氯霉素标准品，然后加氯霉素特异性抗体，待测样品中残留的氯霉素和酶标板上包被的氯霉素抗原竞争氯霉素特异性抗体。再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中氯霉素残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氯霉素的浓度。

包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入氯霉素特异性抗体，再加入氯霉素酶标记抗原和样本或氯霉素标准品溶液，待测样本中残留的氯霉素和酶标记氯霉素抗原竞争氯霉素特异性抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中氯霉素残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氯霉素的浓度，与标准溶液颜色比较则可判断样品中氯霉素的浓度范围。

本发明提供了一种检测动物源性食品中氯霉素的酶联免疫试剂盒，它含有：

(1)包被氯霉素抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；

(2)酶标记物；

(3)氯霉素特异性抗体；

(4)氯霉素标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)浓缩复溶液。

本发明所述试剂盒中氯霉素包被抗原是采用活泼酯法将氯霉素半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被氯霉素抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为去离子水或三蒸水；所用的封闭液是含有8％-15％的马血清和1％惰性蛋白的溶液。

本发明所述试剂盒中包被氯霉素抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板的制备步骤为：

(1)用包被缓冲液将氯霉素半抗原与牛丙种球蛋白(BGG)偶联物或抗抗体以0.02-0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，拍干；

(3)向酶联板的每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。

本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记氯霉素抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50％甘油(可防止放入-20℃环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1％的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。

本发明所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为：

(1)抗抗体的制备：以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。