[发明专利]人脂联素酶联免疫吸附检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人脂联素酶联免疫吸附检测试剂盒及其制备方法与应用，尤其是涉及一种检测人血清或血浆中脂联素酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

脂联素(adiponectin，APN)是上世纪90年代中期，最早由Scherer等发现的一种重要的血浆激素蛋白(Scherer PE，WilliamsS，FoglianoM，1995，A novel serum protein similart Clqproduced exclusively in adipocytes.J Biol Chem，270：26746-26749)。APN亦称Acrp30，AdipoQ或GBP28，是脂肪组织分泌的一种特异性血浆蛋白质，在循环中含量丰富，血清浓度为5～30mg/L，约占人血清蛋白总量0.01％，比瘦素、皮质醇、白细胞介素-6等血清蛋白水平高出103～106倍(Shimada K，Miyazaki T，Daida H，2004，Adiponectin and atherosclerotic disease.Clin Chim Acta，344：1-12)。APN主要生物学作用是调节机体的能量代谢，能促进葡萄糖、脂肪的分解代谢，改善胰岛素的敏感性。近年来越来越多的研究表明，APN水平与肥胖、糖尿病、高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等心血管危险因素密切相关，患者血清APN水平较健康人明显降低。APN具有增强胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化(AS)形成、抗炎症和血管损伤后抗内膜增生的作用(Zhu W，Cheng KK，Vanhoutte PM，2008，Vasculareffects of adiponectin：molecular mechanisms and potential therapeutic intervention.Clin Sci(Lond)，114：361-74)。因此，检测血中APN的含量，对于认识其生理学功能、调控机制及与II型糖尿病、冠心病、高血压等疾病发生发展的关系有重要意义。

目前，检测人血APN含量的方法主要有放射性免疫分析方法(RIA)及酶联免疫吸附方法(ELISA)两种，其中RIA由于放射污染和危害，已较少使用。ELISA方法灵敏度高，特异性强，酶标记试剂比较稳定，而且易与其他相关技术偶联，因此应用广泛。但现有ELISA试剂盒价格高昂，使用操作也还尚欠方便，检测花费时间较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用操作简便，灵敏度高，特异性强，成本低的定量检测人血清或血浆中的APN浓度的ELISA试剂盒及其制备方法与应用。

本发明之APN定量ELISA试剂盒，其组成包括抗人APN单克隆抗体包被的酶标板，标准品冻干粉，检测抗体，酶标亲和素HRP-链霉素，样本试剂稀释液，TMB酶底物显色液，浓缩洗涤液0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液和终止反应液2M H2SO4，其中：

标准品冻干粉为重组的gAPN蛋白标准品；

检测抗体为生物素标记的抗人APN单克隆检测抗体；

样本试剂稀释液为10mM pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中含有0.05％Tween-20；

所述百分比为体积百分比。

所述APN定量ELISA试剂盒的制备方法：包括抗人APN单克隆抗体包被的酶标板、重组的gAPN蛋白标准品、检测抗体为生物素标记的抗人APN单克隆检测抗体的制备及10mMpH7.4的磷酸盐缓冲液和0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲液及2M H₂SO₄的配制，其中：

重组的gAPN标准品的制备方法是：应用PCR方法获得脂联素球状结构域gAPN基因，构建pET22b(+)/gAPN重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21菌株，IPTG诱导表达His-gAPN融合蛋白，利用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，SDS-PAGE及Western blot分析表达产物；

生物素标记的抗人APN单克隆检测抗体的制备方法是：按照Sigma公司生产的抗体生物素化试剂盒标记抗人APN单克隆抗体MAB1065。

将本发明试剂盒应用于人血中APN含量的检测，包括以下操作步骤：

(1)将浓度为0.9375ng/ml-15ng/ml的重组gAPN蛋白标准品溶液和按1∶2000稀释的样本加入到相应的包被抗体的酶标板孔中，空白孔中只加入100μl样本稀释液；在37℃下孵育30min，使样品或标准品中的APN与固相载体上的抗体结合，用洗涤液(以浓缩稀释液稀释10倍后使用)洗去未结合的杂蛋白和其他物质；