[发明专利]一种融合蛋白及其用于检测荚膜组织胞浆菌的用途

说明书

技术领域

本发明涉及融合蛋白及荚膜组织胞浆菌的检测，特别涉及用酶联免疫吸附试验检测荚膜组织胞浆菌的方法。

背景技术

荚膜组织胞浆菌病(Histoplasmosis，HP)由双相型真菌荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum，HC)引起。我国自1958年报道首例HP以来，陆续有该病的临床报道。但由于荚膜组织胞浆菌病的临床症状与肺结核、黑热病相似；病理形态又极易与马尔尼菲青酶菌、杜氏利什曼原虫、弓形虫、新型隐球菌等相混淆，而国内临床医务工作者又对该病的认识普遍不足，故存在高漏诊率和高误诊率现象，播散型HP常因未得到及时正确的治疗而死亡。因此加强对HP快速诊断的研究成为必要，以期能尽量减少国内较高的漏诊误诊现状，降低该病的病死率。

目前，国内外对于HP的诊断有如下几种方法：

1.真菌培养：取临床标本接种固体或液体培养基，观察菌落特征与镜下形态、霉菌相与酵母相的转化；尿素酶反应等。该方法特异性好，为判断HP的金标准，但耗时长，操作繁琐，不便于早期快速筛查。

2.病理学检查：取病变组织涂片、固定、染色，镜下观察荚膜组织胞浆菌形态特征。但由于组织胞浆菌病理形态与杜氏利什曼原虫等相似，故该方法难以大规模推广。

3.变态反应：接种荚膜组织胞浆菌于葡萄糖琼脂斜面培养基，培养一段时间后，转接至液体培养基继续培养，收集培养上清，经纯化处理后，制得荚膜组织胞浆菌素。使用时，疑似患者前臂屈肌表面皮内注射该荚膜组织胞浆菌素，注射后48小时观察红肿及结块大小，以5毫米作为阳性片段标准。皮试阳性揭示曾受过或正在受荚膜组织胞浆菌感染，有一定的诊断价值。但由于荚膜组织胞浆菌素组成成份复杂，与其它病菌的组成成份相互交叉，所以可能存在一定程度上的假阳性。

4.血清学诊断：以往荚膜组织胞浆菌血清学检查常用到的方法有免疫双扩法、补体结合实验等。近年来血清学诊断有所发展，通过检测血液、脑脊液和尿液中的荚膜组织胞浆菌抗原成份以判断感染荚膜组织胞浆菌与否。此方法灵敏度高、操作简便，可提供早期诊断依据。必须指出的是，血清学诊断的敏感性和特异性与用于检测的抗原/抗体的活性及其特异性密切相关。目前用于检测荚膜组织胞浆菌抗体的抗原来源于荚膜组织胞浆菌蛋白提取物，其制备工艺复杂，并且耗时、耗力，更为严重的是其成份复杂，导致检测结果灵敏度高但特异性差。

5.基因诊断：通过PCR方法扩增荚膜组织胞浆菌的特异性基因片段以用于该菌的鉴定、分型及流行病学调查。该方法敏感性好、特异性高，但由于仪器的限制，该方法无法在基层医疗机构大规模推广。

因此，建立一种快速、简单，特异性好的荚膜组织胞浆菌的检测方法，将对荚膜组织胞浆菌病的大规模临床鉴别诊断及快速诊断具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17及编码该融合蛋白的DNA，以及该融合蛋白在检测荚膜组织胞浆菌中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种将荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17基因转化宿主细胞并通过载体特异性表达荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17的方法。

本发明的又一目的在于提供一种包含荚膜组织胞浆菌融合蛋白M-GH17的ELISA试剂盒及其用于检测荚膜组织胞浆菌的用途。

为实现上述发明目的，发明人以分离的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增得到M基因(GenBank登录号为AF026268)的特异性片段和GH17基因(GenBank登录号为ACU27588)的特异性片段；所说的M基因片段和GH17基因片段的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。在原核表达载体中定向插入荚膜组织胞浆菌M基因片段，构建得到M基因片段的重组原核表达载体；在该重组原核表达载体中再定向插入荚膜组织胞浆菌GH17基因片段，构建得到M-GH17基因片段重组原核表达载体；将M-GH17重组原核表达载体转化宿主细胞，筛选重组单克隆，诱导后特异性表达，得到融合蛋白M-GH17。

本发明中，原核表达载体最好选用PET-28a(+)。M-GH17重组原核表达载体转化宿主细胞时，宿主细胞选用大肠杆菌。采用卡那青霉素抗性筛选重组菌单克隆，以丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后特异性表达，分离纯化后得到。

本发明制备融合蛋白M-GH17的更进一步的详细步骤为：

1)以分离的荚膜组织胞浆菌基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增得到荚膜组织胞浆菌M基因片段和GH17基因片段。