[发明专利]大家白蚁快速PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物物种分子诊断领域，具体的说是一种对大家白蚁进行快 速检测的PCR检测方法。

背景技术

白蚁隶属于昆虫纲等翅目(Isoptera)，共有7科286属2860余种，是 一类世界性的重要害虫。我国已记载的白蚁超过400种，具有较大危害性的白 蚁种类繁多，特别是乳白蚁属(Coptotermes Wasmann，1896)，其中大家白 蚁(C.curvignathus Hollmgren)是世界已知为害严重且易被引进和传播蔓延 的最具威胁的白蚁种之一。该白蚁适应性强，分布广，繁殖迅速，不仅能危 害多种树木，蛀食坚硬的木材甚至含纤维素的木材加工品如纸、棉布、皮革 制品等，还能危害埋地通讯电缆塑料护套层和农林作物。该白蚁的危险性不 仅表现在它所造成的损失，更重要的是它在传入或输出后能在新的地域快速 建群、繁殖、扩散，给新的地域造成新的损失和危害。我国的淮河以南地区 是大家白蚁的适生地区，特别是广东、广西、海南、云南和福建等地处亚热 带和热带的气候条件，森林资源丰富，降雨量充足，是大家白蚁种群理想的 栖息地。一旦传入，筑巢建群，将给我国的森林资源、环境资源以及建筑业 等造成难以估量的损失。

长期以来，有关白蚁的分类和鉴定单纯依赖于物种的生物学性状、形态 解剖学的主要特征，结合生物地理学信息为依据；由于昆虫许多表型特征的 保守性，且易受环境的诱变，在种内也存在一定的形态变异范围，来自不同 地理种群的生物型其行为学和生物学特点也存在差异。因而传统的以形态学 进行的鉴定不仅主观而且繁琐，难以可靠地分析和鉴别近似种间存在的差异， 更难于揭示不同类群的昆虫在进化过程中的亲缘关系。有关乳白蚁属种类的 鉴定难度为世界白蚁分类专家所公认，该属下各种，形态彼此极为相似，同 时相当数量的种类，其兵蚁头型有变异，而且大量使用白蚁各个部位的大小 度量作为区分近似种的特征，有时还是重要特征，这也给鉴定工作带来非常 大的困难。此外，在白蚁现场检疫时不易获得兵蚁品级，获得有翅成虫的几 率更低，仅仅依据工蚁形态特征很难鉴定到种级水平，结果也不可靠。这种 以兵蚁的形态学和解剖学的主要特征，结合形态测量值为主要依据的传统鉴 定方法，受环境和地理条件的影响相当大，并且不同地理分布的白蚁在形态 数据测量上也不尽一致，导致实际鉴定过程中可靠性低，准确性差，漏检、 错检普遍，并不符合检验检疫口岸快速通关的要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速、稳 定可靠、灵敏度高的大家白蚁PCR检测方法。

如图1所示，编码核糖体RNA的基因(rDNA)是真核生物中最为保守的 结构基因，它以衔接重复的方式排列，每一个重复包括三个编码区(分别编码 18S，5.8S和28S RNA基因)，编码区之间被两个ITS(Internal Transcribed Spacers)所分隔，重复之间分别被一个ETS(External Transcribed Spacer)和 一个IGS(Integenic Spacer)所分隔，由于rDNA在基因组内有数百个拷贝(增 加了检测的灵敏度)和ITS及IGS区域在种内的稳定性及种间的差异，使其 成为许多生物遗传变异研究的重要对象，也是近年来昆虫遗传变异、系统进 化及分子鉴定研究中的一个热点，已有的研究表明：许多昆虫同一类群不同 种的ITS区域在碱基序列的长度上高度保守，并无明显的差异，而核苷酸序 列的却具有高度变异性，是非常理想的昆虫分子标记基因。

本发明通过实验克隆鉴定了大家白蚁、印缅乳白蚁、塞庞乳白蚁、台湾 乳白蚁和婆罗乳白蚁5种乳白蚁18个种群的ITS序列，用于对乳白蚁属种间 以及种内不同地理种群之间的遗传差异进行研究，结果显示ITS序列在乳白 蚁属种内高度保守，种间又有一定程度的变异，是比较好的研究乳白蚁不同 种间系统发育关系的标记基因；其中通过测序得到的大家白蚁ITS序列长度 为904bp，测序结果为(如序列表NO.6)：