[发明专利]一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及肝癌早期诊断血清标志物的一种免疫学检测方法，具体涉及一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

肝脏是人体最大的器官，肝脏疾病也是发病率和死亡率最高的疾病。由于肝脏具有很强的代偿能力，部分损伤往往无临床表现，导致肝脏疾病潜伏性强，待有临床表现时，已经是肝病晚期，难以有效治疗。目前，能够在临床上开展的肝功能试验种类繁多，但是每一种试验只能探查肝脏的某一方面的某一种功能，到现在为止仍然没有能反映肝脏的大部分功能的指标，因而，往往引起漏检。目前肝癌治疗最有效的手段是手术切除，但由于缺乏早期诊断手段，其治疗的效果并不理想，65％的肝癌患者发现并确诊时，病情已经晚期，失去了根治手术的时机，约80％的患者在诊断后很快就死亡，因此肝癌的生存率非常低，这主要是因为目前尚缺乏有效的早期诊断手段。

目前对于肝脏疾病的诊断主要依靠肝功能检测。临床应用较为广泛的肝功能指标有：①反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)。②反映肝细胞有无受损及严重程度的指标：谷丙转氨酶(AIJT)、谷草转氨酶(AST)、腺苷脱氨酶(ADA)、胆碱酯酶(ChE)、乳酸脱氢酶(LDH)等。③反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的指标：总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆酸(TBA)、血氨(NH)。④对诊断胆汁淤积指示酶(包括同工酶)有帮助的酶：碱性磷酸酶(ALP)、r.谷氨酸转肽酶(GGT)、5-核苷酸酶(5-NT)。⑤反映肝脏间质成分增生(肝纤维化和肝硬化)的指标：III型前胶原氨基端肽(PIIIP)、III型原胶原(PCIII)、IV型胶原c端原肽(CIV/PC)；层黏蛋白(LN)；透明质酸(HA)。⑥对肝肿瘤诊断有意义的血清标志物：甲胎蛋白(AFP)。

然而现行的种种肝功能试验只能反映肝功能的一个侧面，并不能反映肝功能改变的全貌，到目前为止，仍缺乏令人满意的有效诊断肝脏疾病的早期检测手段。因此，本领域迫切需要开发一种新的有效检测肝脏异常的方法。

GP73，又名Golm1或Golph2，是主要定位在高尔基体上一种蛋白质，是一个II型跨膜蛋白，具有5个糖基化位点，分子量约45KD，糖基化后约为73KD，其在GeneBank中的序列号为51280。该蛋白基因序列保守，从两栖类到灵长类，都有其同源蛋白，功能相当保守，在正常人肝脏组织表达量很低，而有肝脏疾患的病人肝脏中却大量表达。国外的相关研究认为，GP73在肝癌患者体内表达量会很高，而病毒性肝炎，肝硬化、肝损伤患者与健康人的GP73含量比较低，所以将其作为肝癌早期诊断标志物；目前只有免疫印迹检测GP73的方法，还没有酶联免疫法检测GP73；免疫印迹方法操作繁琐，灵敏度和特异性都没有酶联免疫法高。而在我们的研究中显示，病毒性肝炎，肝硬化和肝损伤患者的SGP73含量也明显高于正常人，因此提出将GP73作为肝脏异常的标志物。

根据发明人所进行的资料检索，国内外尚无其他有关检测GP73双单抗夹心ELISA方法的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种快捷、灵敏、稳定的GP73定量检测方法，以弥补现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法采用两株针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色检测GP73，通过标准品制备的标准曲线确定GP73的含量。

优选的，所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体之一识别的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的序列。

优选的，所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体之一识别的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列。

本发明获得的识别SEQ ID NO：1的单克隆抗体有三株，分别命名为1F2，1A6和5F10；识别SEQ ID NO：2的单克隆抗体有两株，分别命名为5B12和9D2。通过配对实验，选择出适合夹心ELISA检测GP73的最佳mAb₁-mAb₂配对有5B12-5F10；5B12-1A6；5F10-1A6。

所述的包被抗体mAb₁的浓度为1～5μg/mL。