[发明专利]诱导多能性干细胞快速高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法

说明书

一.技术领域

本发明涉及一种能够快速有效地将体细胞诱导重编程为多能性干细胞(induced Pluripotent stem cell，iPS)的无血清培养基，以及使用该无血清培养基在无需饲养层(feeder)的条件下诱导重编程体细胞的方法，其中所有诱导重编程的速度以及效率均大大提高。此外，本发明还涉及所述培养基用于诱导多能性干细胞的用途，以及用于筛选化合物，尤其是化合物的高通量筛选的方法 

二.发明背景 

干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源分为成体干细胞(somaticstem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)。成体干细胞包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的。 

1981年，ES细胞的分离和培养首先在小鼠中获得成功，是至今研究最广泛、最成熟的干细胞体系。随后，牛、羊等大动物的ES细胞分离和培养也相继获得成功。 

hES细胞研究的应用前景主要是移植治疗，在组织工程学领域中以hES细胞作为种子细胞，可为临床上细胞、组织或器官的移植治疗提供大量的材料。通过控制hES细胞分化培养环境、转染能够促进ES细胞定向分化的关键分子基因等体外诱导分化策略，可获得特异性的组织细胞类型。这类细胞用于移植治疗，将给糖尿病、帕金森氏病、脊髓损伤、白血病、心肌损伤、肾衰竭、肝硬化等疾病的治疗带来新的希望。 

一直以来，hES细胞研究面临着许多难题和争议，主要包括以下几个 方面：(1)供体卵母细胞的来源困难，hES细胞建系效率低。此外，SCNT技术的不成熟必将需要进一步耗费更多的人类卵母细胞，故而其来源难以得到保证。(2)免疫排斥反应，除非采用SCNT技术，否则患者对hES细胞分化而来的各种细胞和组织仍然存在免疫排斥反应。(3)hES细胞具有成瘤性，移植到受体的体内后有发展为肿瘤的可能性，即使采用SCNT技术、给移植细胞设置自杀基因等应对措施，也不一定能够很好地解决这个问题(Reubinoff BE等人.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation in vitro。Nat Biotechnol 2000；18：399-404；Richards M等人，Bongso A.Human feeders support prolongedundifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stemcells.Nat Biotechnol 2002；20：933-936；Burdon T等人，cell cycle andpluripotency in embryonic stem cells.Trends Cell Biol 2002；12：432-438)。(4)体外保持hES风险(Nakagawa M，等人，N，Yamanaka S.Generation ofinduced pluripotentstem cells without Myc from mouse and humanfibroblasts.Nat Biotechnol 2008；26：101-106)。同样，慢病毒转染技术可能也存在类似的风险。 

为避开hES细胞和治疗性克隆研究的伦理学争论，需要找到一种替代途径，以便将人类的体细胞直接转化为多潜能干细胞，为患者提供“个性化”的自体干细胞。2003年，Gurdon研究小组发现，将已完全分化的小鼠胸腺细胞或成人外周血淋巴细胞的细胞核注入爪蟾卵母细胞后，哺乳动物细胞核的分化标志物丧失，而哺乳动物干细胞中最具特征性的标志物Oct4则呈高表达，提示哺乳动物细胞核可直接被两栖动物卵母细胞核泡所重构从而表达Oct4(Byrne JA等人，Nuclei of adult mammalian somaticcells are directly reprogrammed to oct-4stem cell gene expression byamphibian oocytes.Curr Biol 2003；13：1206-1213)。