[发明专利]诱导多能性干细胞快速高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法

权利要求书

1.诱导多能性干细胞的无血清培养基，其包含基础培养基、代血清添加剂、一个或多个酪氨酸激酶，所述的基础培养基包括葡萄糖含量为4.5g/L的DMEM，所述的代血清添加剂包括KOSR或包括KOSR和N2，所述的酪氨酸激酶包括bFGF、EGF、IGF2或VEGF。

2.权利要求1所述的无血清培养基，其还包含白血病抑制因子（LIF）。

3.权利要求1或2所述的培养基，其中在最终培养基中N2的浓度在0%-1%之间。

4.权利要求3所述的无血清培养基，其中在最终培养基中KOSR的浓度在5%-20%之间、N2的浓度在0%-1%之间。

5.权利要求1所述的无血清培养基，其中代血清添加剂是由KOSR和N2所调配而成的。

6.权利要求5所述的无血清培养基，其中在最终培养基中KOSR的浓度为5%-20%，N2的浓度为0%-1%。

7.权利要求6所述的无血清培养基，其中在最终培养基中KOSR的浓度为10%，N2的浓度为0.5%。

8.权利要求1所述的无血清培养基，其中酪氨酸激酶为bFGF。

9.权利要求8所述的无血清培养基，其中在最终培养基中bFGF的浓度在3-20ng/mL之间。

10.权利要求9所述的无血清培养基，其中在最终培养基中bFGF的浓度在5-15ng/mL之间。

11.权利要求10所述的无血清培养基，其中在最终培养基中bFGF的浓度为5ng/mL或7ng/mL。

12.权利要求1所述的无血清培养基，其中酪氨酸激酶为EGF。

13.权利要求12所述的无血清培养基，其中在最终培养基中EGF的浓度为10ng/mL。

14.权利要求1所述的无血清培养基，其中酪氨酸激酶为IGF2。

15.权利要求14所述的无血清培养基，其中在最终培养基中IGF2的浓度为25ng/mL。

16.权利要求1所述的无血清培养基，其中酪氨酸激酶为VEGF。

17.权利要求16所述的无血清培养基，其中在最终培养基中VEGF的浓度为10ng/mL。

18.权利要求1-2、5至16中任一项所述的无血清培养基，其中所述培养基还包含其它组分，其中其它组分选自L-谷氨酰胺、NEAA MEM，丙酮酸钠和2-巯基乙醇。

19.权利要求3所述的无血清培养基，其中所述培养基还包含其它组分，其中其它组分选自L-谷氨酰胺、NEAA MEM，丙酮酸钠和2-巯基乙醇。

20.从体细胞诱导多能性干细胞的方法，其包括：

（a）将干细胞多能性因子导入体细胞，所述的导入体细胞的干细胞多能性因子包括Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的4因子组合或Oct4、Sox2、Klf4的3因子组合；

（b）用权利要求1-16中任一项所述的无血清培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养（a）中经导入的体细胞，以诱导体细胞成为多能性干细胞；

（c）检测并且分析经诱导的细胞的多能性；

（d）挑出具有多能性的经诱导的多能性干细胞的单克隆；

（e）在适于胚胎干细胞生长的条件下在胚胎干细胞培养基中培养（d）中的单克隆细胞； 

所述体细胞来源于小鼠，所述体细胞为成纤维细胞。

21.权利要求20的方法，其中导入的方法选自病毒感染、转染、转座子介导的插入表达、穿膜蛋白或药物诱导。

22.权利要求21所述的方法，其中病毒感染为使用逆转录病毒或慢病毒。

23.权利要求20-22中任一项的方法，其中检测细胞多能性的方法包括鉴定多能性分子标记的表达、细胞的DNA甲基化状态检测、胚胎小体EB的形成、畸胎瘤的形成或使用经诱导的多能性干细胞的嵌合鼠的形成。