[发明专利]一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测临床样品中21号染色体数目异常的试剂盒，特别是涉及以多重杂交特异扩增技术通过检测母血浆中胎儿游离核酸多态性来实现无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒。

背景技术

21-三体综合征是胎儿最常见的染色体病，在新生儿中的发病率约为1/800，占小儿染色体病的70-80％，发病率随着母亲年龄的增高而增高。目前我国大约有100万以上的患者，平均20分钟就有一例21-三体综合征患儿出生，全国每年出生的21-三体综合征患儿可多达27万例左右。21-三体综合征患者由于多了1条第21号染色体，主要表现为智力低下，发育迟缓和特殊面容。由于21-三体综合征给父母、家庭和社会带来了无可挽回的痛苦和沉重的精神负担，因此对高龄孕妇等高危人群进行产前诊断尤为重要和必要。当前在进行产前诊断时，必须采取创伤性的手段获取胎儿细胞样本如羊水或者绒毛组织，尽管这些创伤性的手段相对比较安全，但是对胎儿和母亲仍然存在一定的风险，因此临床上只对可能怀有遗传异常胎儿的高风险孕妇进行产前诊断。为了避免潜在的风险，在过去几十年中，人们一直广泛应用的方法是从母血中分离胎儿有核红细胞，但是由于胎儿有核红细胞在母血中含量稀少，需要进行细胞富集等种种操作程序限制了该方法的发展和实际应用。

2000年，Poon等发现了母血浆中存在胎儿游离核糖核酸(RNA)。目前研究发现母血浆胎儿RNA的稳定存在可能是由于合体滋养层微颗粒的保护而避免了血浆中RNA酶的消化作用，同时研究也发现胎盘是游离胎儿RNA主要的来源，并且来源于胎盘的RNA容易被检测到。母血浆中一些胎儿游离RNA同性别无关，且母亲自身无表达，如位于21号染色体上胎盘特异表达的PLAC4基因。由于在一个正常胎儿，人类染色体的二倍体性使得杂合性SNP(单核苷酸多态性)其等位基因剂量比例将会出现1∶1，而对于一个21-三体的患儿，其等位基因的剂量比例将会为1∶2或者2∶1。对于基因编码区的SNP位点而言，每条染色体上特定基因携带的这些SNP位点必将随着转录而传递到mRNA(信使RNA)上，成为“RNA-SNP”，杂合性的RNA-SNP位点的基因剂量比例也必定符合基因组DNA杂合性SNP剂量的比例情况，因此可以用母血浆中胎盘表达的mRNA来无创性的评估胎盘细胞染色体数目异常与否，也就可以评估胎儿染色体数目异常与否。

多重杂交特异扩增技术(Multiplex Hybri dization-specific Amplification，MHSA)，是一种灵敏度极高的相对定量技术，它利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应体系内检测多达40个不同核酸序列拷贝数变化，最低只需要20ng核酸样本并且可以检测到序列内单个核苷酸的变化，可用琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳或毛细管电泳等方法进行检测。

MHSA的原理是将制备的长型探针和短型探针同目的基因序列杂交，杂交后短探针的5’-端和长探针的3’-端彼此能够通过连接酶连接成一条DNA片段。不匹配的探针杂交后不能被连接酶连接。所有被连接的DNA序列都有共同的5’和3’末端，因此可以仅仅用一对引物在一个PCR体系中扩增不同的目的基因序列。由于长型探针有片段大小可变的中间序列，因此每对MHSA探针组可以扩增出特定片段大小的一段序列。通过电泳的方法即可以分辨出不同的目的基因序列。该技术目前广泛应用于染色体疾病、SNP位点检测和mRNA表达研究。

本发明人应用多重杂交特异扩增技术并结合电泳，通过精确定量母血浆中胎儿21号染色体上胎盘特异表达的PLAC4的SNP剂量比例，建立一种可以快速、准确、无创性筛查21-三体的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒，该试剂盒以多重杂交特异扩增技术(MHSA)检测母血浆中胎儿游离核酸，通过扩增21号染色体特异性的SNP位点，并根据扩增产物剂量的差异分析染色体数目异常。

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

(1)设计一个五重复合杂交-连接-扩增体系，以扩增染色体特异性的SNP位点；

(2)针对一组特异性染色体的的SNP位点进行检测和分析；

(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。