[发明专利]检测四种/四种以上侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速诊断试剂盒及其应用方法，尤其涉及一种检测四种/四种以上侵袭性念珠菌的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法。属于真菌核酸检测技术领域，适用于临床及科研中对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌及其他侵袭性念珠菌的快速检测。

背景技术

近年来，随着器官移植、骨髓移植的广泛开展，艾滋病和肿瘤患者的增多以及皮质类固醇激素、广谱抗生素、免疫抑制剂的大量应用，侵袭性念珠菌感染的发病率明显增高。美国的一项前瞻性研究显示，真菌感染占医院血行感染的9.5％。念珠菌感染对免疫抑制和免疫缺陷病人的危害性大，死亡率高达45％，已成为威胁患者生命最严重的并发症之一。研究表明，尽管白色念珠菌仍是侵袭性念珠菌感染最主要的病原菌，但其在临床分离菌中所占的比例逐年下降，而热带念珠菌等非白色念珠菌(non-albicans Candida，NAC)感染比例呈上升趋势，且克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，光滑念珠菌对此药不敏感，给临床的治疗带来一定的困难。既往研究发现，早期有效的抗念珠菌治疗可以显著改善预后。因此，早期确诊侵袭性感染念珠菌菌种，对其实施针对性治疗，及时救治生命具有重要意义。

然而，侵袭性念珠菌感染的临床表现缺乏特异性，不同病原菌之间在毒力、感染部位、药物敏感性以及临床预后等方面均有差异，对其做出诊断常需结合实验室诊断结果。目前侵袭性念珠菌的实验室诊断方法包括真菌培养和表型检测法、血清学检测法、组织病理切片鉴定法与分子生物学鉴定技术等。真菌培养受取材时间、取材部位、样本因素、培养条件等因素的影响，阳性率一直很低，且费时费力，常规培养需要3天，不能发挥指导临床早期针对性治疗的作用。血清学方法虽然因操作过程简便而广受实验室欢迎，但该方法应用范围窄，又存在交叉抗原，易出现假阳性或假阴性，且无法鉴定到种，无法满足诊断需要。组织病理鉴定法是临床侵袭性念珠菌病的确诊方法，但因该法是有创性检查，患者较难接受，且重症侵袭性真菌感染患者，常常伴有血小板减少，凝血功能差，一般不宜采用组织活检方法。该方法阳性率低。因此，前述的实验室诊断方法限制了其在临床诊断中的运用。

由于分子生物学方法特异性和敏感性高，并且可快速诊断，是目前真菌感染诊断研究中最活跃的一种方法；荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术具有自动化程度高、操作过程全封闭、无污染、实时性、能实现多重反应等优点，已广泛用于病毒、细菌等病原体的检测；因此，本发明基于分子生物学方法，研究一种检测侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法。

发明内容

本发明的第一个目的，是为了克服现有技术中的不足，提供一种检测四种/四种以上侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒。

本发明的第二个目的，是为了提供检测四种/四种以上侵袭性念珠菌快速诊断试剂盒的应用方法。

本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：

检测四种/四种以上侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒，包括盒体，其特征是：

1)在所述试剂盒内设有荧光定量PCR反应液、至少四种念珠菌的阳性质控品和阴性质控品；

2)所述荧光定量PCR反应液含有特异性引物和四种念珠菌相对应的荧光探针，所述特异性引物序列如序列表SEQ ID№：1所示；

3)所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌或由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌加上若干种其他侵袭性念珠菌的标准菌株经“煮沸法”获得的DNA样品；所述阴性质控品为灭菌三蒸水。

本发明的第一个目的还以通过采取如下技术方案达到：

本发明的一种实施方式是：所述侵袭性念珠菌的阳性质控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌的标准菌株经“煮沸法”获得的DNA样品；与白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌相对应的荧光探针序列如序列表SEQ ID№：2所示。

本发明的一种实施方式是：所述其他侵袭性念珠菌可以是近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌和乳酒念珠菌中的一种或二种以上组合。

本发明的一种实施方式是：所述荧光定量PCR反应液包括：25μl反应体系包括Brilliant QPCR Master mix II 12.5μl，通用引物(0.1mmol/l)各0.5μl，四条探针(0.1mmol/l)各0.25μl，DNA模板1μl，补DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水至25μl。