[发明专利]菊花滑刃线虫的检测方法及诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测或鉴别菊花滑刃线虫的方法以及一种可检测 菊花滑刃线虫的诊断试剂盒。

背景技术

菊花滑刃线虫(Aphelenchoides ritzemabosi)是花卉重要的植 物寄生线虫病害之一，其寄主广泛，能在观赏植物、蔬菜类、小果类和 杂草等200多种植物上寄生。该线虫主要危害叶片，同时也能侵染花芽 和花。该线虫除危害菊花外，还危害翠菊、金光菊、大丽菊、百日草等 多种菊科植物，以及茄科植物或罂粟科植物，或烟草、草莓、珠兰、百 合、蒲包花、飞燕草、夹竹桃等作物或花卉。被害株叶片枯死，开花不 好或不能开花，重则整株变黑，最终导致植株枯死。菊花滑刃线虫分布 广泛，在日本、美国菊花叶线虫病被认为是菊花的灾难性病害。全世界 有75个国家在菊花上发现这种病害，损失率达12.3％，因而被我国列 为对内对外重要的检疫线虫。

菊花滑刃线虫主要是种苗带病传播，一旦侵入植株就难以用药剂防 治，只能及时拔除，集中烧毁，因此防治的主要措施是通过检疫进行隔 绝。然而，目前的检测手段主要是用直接浸泡法或贝曼漏斗法分离线虫， 然后镜检，根据菊花滑刃线虫的形态特征进行判断。这种方法存在一定 的弊端，主要表现在：一、菊花滑刃线虫属于滑刃线虫属，滑刃线虫种 类繁多，通常鉴定的样品中会有多种形态相似的线虫，这就要求鉴定者 具有丰富的经验；二、线虫个体间存在差异，这需要有足够的鉴定样本； 三、形态学鉴定只适用于成虫，而对于幼虫不适用。因此，研究出对菊 花滑刃线虫快速、准确的检测方法实为必要。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明的目的之一在于提供一种快速、准确地检 测出菊花滑刃线虫的方法。本发明的另一目的在于提供菊花滑刃线虫诊 断用试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供的菊花滑刃线虫的检测方法包括：

(a)从可疑植物材料或土样中分离出待检测线虫，提取DNA；

(b)以步骤(a)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物，进行聚合酶链式反应，得到扩增产物；

(c)检测步骤(b)中获得的扩增产物，根据检测结果判断菊花滑 刃线虫的存在。

优选地，步骤(c)中所述的检测的方法为电泳检测，更优选为琼 脂糖凝胶电泳。通过琼脂糖凝胶电泳可方便、快捷地检测出扩增产物中 是否含有特异性扩增的片段，以及该片段的大小。

本发明的方法利用分子生物学原理，使用发明人设计的如序列表中 所列的一对特异性引物，来扩增菊花滑刃线虫的基因组DNA。如果待检 测的线虫确为菊花滑刃线虫，则通过聚合酶链式反应(PCR)后可获得 扩增的特异性片段，当电泳检测时，会显示出特异性条带；如果待检测 的线虫非菊花滑刃线虫，则通过PCR后不能获得扩增的特异性片段，当 电泳检测时，就不会显示出特异性条带。因此，可通过电泳检测结果中 是否出现特异性条带来判断出待检测线虫是否为菊花滑刃线虫。

为更好地实现本发明，针对不同数量的线虫，其DNA提取方法可分 为：

(1)当所述可疑植物材料或土样中存在大量线虫时，采用Miniprep DNA提取法分离出DNA。

(2)当所述可疑植物材料或土样中存在单条线虫时，步骤(a)中 所述的提取包括以下步骤：

(i)将单条线虫加入含有WLB溶液的管中；

(ii)于-70℃放置30-60min；95℃放置15-20min；55-65℃放 置2min；

(3)再加入蛋白酶K，55-65℃处理30min-2h；95℃处理15-20min， 以获得作为单条线虫DNA模板的产物。

优选地，上述植物材料是菊科植物材料、茄科植物材料或罂粟科植 物材料。所述菊科植物选自翠菊、金光菊、大丽菊和百日草的种苗或植 株。

在另一实施方式中，所述植物材料是烟草、草莓、珠兰、百合、蒲 包花、飞燕草或夹竹桃的种苗或植株。

另一方面，为了更方便地使用本发明的方法，本发明还提供一种用 于诊断菊花滑刃线虫的试剂盒，其包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的 引物对。

本发明的方法适用于土样、种苗和植株样品中菊花滑刃线虫的快速 检测和鉴定，与现有方法相比，本发明的优点表现在：