[发明专利]检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以荧光定量聚合酶链反应技术检测临床样品中WT1基因mRNA表达的试剂盒。

背景技术

WT1在正常成人体内只局限于在肾小球细胞，造血干细胞等中表达。当其与转录因子如p53或EGR-1等相互作用时，会表现出致癌基因的特性。HL60和K562细胞株强烈表达WT1，而且WT1的反向寡核苷酸通过致K562和MM6细胞凋亡，使表达WT1的癌细胞株(K562，HEL，THP-1等)被抑制，但WT1的反向寡核苷酸对不表达WT1的细胞株(U937)则没有任何作用。

研究发现WT1与多种造血系统恶性疾病有密切的关系。WT1常常在成人及儿童急性白血病(AL)，慢性白血病(CL)，脊髓发育不良症(MDS)中过度表达。临床研究指出高表达量的WT1与成人及儿童急性髓性白血病(AML)，儿童的急性淋巴性白血病(ALL)，和MDS的预后不良往往是有联系的——WT1基因表达量越高，预后越差。而且越来越多的研究认为该基因参与了人类白血病的致病过程。

年龄和治疗前的染色体核型是目前公认的影响AML预后的重要因素。50％～60％的成人原发AML患者的治疗前骨髓中可检出获得性染色体异常(10％～20％为复杂核型)，而40％～50％的患者未能发现异常。被纳入中危组的正常核型AML是细胞遗传学分类中人数最多的一个亚型，但该组的长期生存率只有40％。非常有必要寻找一种特异的分子标记去评价预后，预示复发，从而对患者加强治疗，改善其生存质量及延长生存期。而WT1基因的检测提供了一个很好的选择。

总而言之，WT1基因在各类白血病患者中均有不同程度的表达，因而WT1基因可作为一种广谱的白血病标志物用于判断疗效、预后及微小残留病(MRD)监测。特别是作为染色体核型正常的AML患者理想的MRD检测指标。对目前检测WT1基因mRNA表达的方法主要为实时荧光定量PCR技术。

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。

实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct)的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR将DNA扩增与检测过程融合为一体动态检测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此的造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology..Nucleic Acids Res.20025；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitativePCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion in Biotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。