[发明专利]检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒

权利要求书

1.一种检测样品中WT1基因mRNA的试剂盒，试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液、逆转录反应体系、经焦碳酸乙二酯处理的纯水、PCR扩增反应液、阴性对照样品、阳性定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液包括正向引物、反向引物、两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，其特征在于所使用的正反向引物的序列分别为：5’-CCAGCTCAGTGAAATGGACAGA-3’、5′-GATGGGCGTTGTGTGGTTATC-3′，寡核苷酸探针的序列为：5’-CAGAGCAACCACAGCACAGGGTACGA-3’。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列还可以为：5’-AGCACAGGGTACGAGAGCGATA-3’、5′-CGTGCGTGTGTATTCTGTATTGG-3’，寡核苷酸探针的序列还可以为：5’-AACGCCCATCCTCTGCGGAG-3’。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列还可以为：5’-CGGTGCTTCTGGAAACTACCA-3’、5’-AGGGCCTGTGAGTCAACTAAAAGTA-3’，寡核苷酸探针的序列还可以为：5’-CTGGAAGAGTTGGTCTCTGCCCT-3’。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于PCR扩增反应液所使用的正反向引物的序列还可以为：5’-TCTACTGTAAGAAGAGCCATAGCTGATC-3’、5’-CAGCGAAAACGAGCATAAAAAA-3’，寡核苷酸探针的序列还可以为：5’-TCCCCCTGACCCTTCCCTTC-3’。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH8.0)、150mMKCl、5mM MgCl₂，每微升的PCR缓冲液中加入2单位Taq酶。

6.根据权利要求1的试剂盒，其中逆转录反应体系由逆转录反应缓冲液、M-MLV酶、dNTPs，逆转录引物和RNA酶抑制剂所组成，其特征在于逆转录引物的序列组合为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。

7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于逆转录反应体系中的逆转录反应缓冲液包含250mM Tris-HCl(pH8.0)、250mM KCl、20mM MgCl₂和50mM DTT，每微升的逆转录反应缓冲液加入50单位M-MLV酶和1单位RNA酶抑制剂。

8.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阳性定量参考品为携带有WT1基因cDNA序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：4和SEQID NO：5，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。

9.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。