[发明专利]一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法

说明书

技术领域

一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR(MC-LR)的方法，属于免 疫分析化学技术领域。

背景技术

随着经济的发展，含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库使水 体富营养化，致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素(Algae Toxins)，威胁 人类的饮用水的安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins， MCs)分布最广、危害最大，其结构如下：

其含有五个固定成分的氨基酸，两个可变的氨基酸X、Y。即在上述的结构式中 其中X和Y分别为Leu和Arg的即为MC-LR。MC-LR是最为常见且毒性又最大的一 种微囊藻毒素，世界卫生组织(WHO)推荐的饮用水中的MC-LR的最大残留限量 为1.0μg/L，我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范(2001，0.001mg/L)和地 表水环境质量标准(GB3838-2002，微囊藻毒素-LR，0.001mg/L)，因此急需建立 针对MC-LR检测的一种快速、简单、灵敏、省力的检测方法。

常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法 等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等， 这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求 也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测 对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法，优点 是快速，数小时即可实现对大量样品的检测，但其最大的不足之处在于特异性 蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度 高，操作简单，专一性好等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素 (MC-LR)的方法，灵敏度高，操作方便，线性范围宽。

本发明的技术方案：一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方 法，包括包被原的修饰，抗体的修饰，修饰的包被原和金纳米棒的偶联，修饰 的抗体和金纳米棒的偶联，反应条件的优化，抑制曲线的测定，实际样本检测；

(1)包被原的修饰：

将微囊藻毒素-LR包被原与硫辛酸相偶联得到修饰的包被原；

(2)抗体的修饰：

将抗微囊藻毒素-LR抗体与硫辛酸相偶联得到修饰的抗微囊藻毒素-LR抗 体；

(3)用步骤(1)得到的修饰的包被原与金纳米棒的端面偶联得到金纳米棒-包 被原探针；

(4)用步骤(2)得到的修饰的抗微囊藻毒素-LR抗体与金纳米棒的端面偶联 得到金纳米棒-抗体探针；

(5)对抑制反应的各个条件进行优化；

(6)标准曲线的建立：利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素-LR和(3) 金纳米棒-包被原探针同时加入到一个离心管中，而后向离心管中加入(4)金纳 米棒-抗体探针，混匀，通过微囊藻毒素-LR和金纳米棒-包被原探针与金纳米棒- 抗体探针进行竞争偶联，通过微囊藻毒素-LR浓度的不同会使形成的粒子形成不 同的粒径分布，通过纳米粒度仪检测粒径的变化从而检测微囊藻毒素-LR的浓 度，建立粒径-微囊藻毒素-LR浓度的标准曲线。

(7)检测样品中微囊藻毒素-LR的浓度。

包被原的修饰：

①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，与0.2mL的微囊藻 毒素-LR包被原溶液混合；

②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入步骤①所述溶液中后 室温反应4h；

③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换液3次；

④将修饰后的包被原放在4℃备用。

抗体的修饰：

①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，与0.4mL抗微囊藻 毒素-LR抗体混合；

②将75μL的碳二亚胺在磁力搅拌的条件下逐滴滴入步骤①所述溶液中后 室温反应4h；

③用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换3次透析液；

④将修饰后的抗体放在4℃备用。