[发明专利]一种纳米金标记-黄曲霉毒素B1新型检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用纳米金标记黄曲霉毒素B₁(AFB₁)人工抗原，利用纳米金银增强原理，结合吸光度检测/溶出化学发光检测技术，建立了AFB₁新型超灵敏检测体系。属于生物细胞学和微生物菌类毒性代谢产物检测方法技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素B₁(AFB₁)是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代谢产物，有极强的毒性和致癌性，可引发动物的肝癌、胃癌、肾癌等，是目前发现的最强的化学致癌物质，还可以通过食物链在生物体之间转移，因而不仅给农民和家禽、家畜生产者造成经济上的损失，而且污染食品继而对人类健康构成一定的威胁。因此，建立准确、灵敏、快速的AFB₁检测技术对于食品安全具有重要意义。

迄今为止，已建立的AFB₁检测方法主要包括薄层色谱法、酶联免疫吸附法和HPLC法等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足实践当中对AFB₁检测的需求。但随着人们生活水平的提高，对涉及食品安全的危害因子(如AFB₁)的限量标准将会越来越低，同时国际食品贸易壁垒的加剧都要求能尽快发展出更灵敏、快速的检测方法。本发明的特点就在于它能实现对黄曲霉毒素的高灵敏检测。

发明内容

本发明涉及采用纳米金标记AFB₁人工抗原，使其与AFB₁标准抗原直接竞争同固定化抗体发生免疫反应，再加入银增强液，银在纳米金上沉积。待测抗原的浓度越大，通过免疫反应结合的金标记抗原就越少，纳米金上沉积的银就越少，颜色(灰度)也越浅，用分光光度法测定该银增强产物的吸光度，即可得出待测AFB₁的量，建立了吸光度检测体系。其次，进一步将银化学溶出，采用溶出化学发光检测技术，通过二次信号放大，建立了金标银增强-溶出化学发光检测体系，实现了AFB₁的超灵敏化学发光检测。

具体实验原理如图1所示。

具体来说，本发明的主要分析步骤如下：

1标准试样制备

1.1本发明所用试液与材料：①AFB₁单克隆抗体溶液；②封闭液(含1％牛血清白蛋白(BSA)的10mmol/L PBS(pH 7.4))；③人工AFB₁抗原溶液；④AFB₁标准溶液；⑤包被缓冲液(pH 9.6的10mmol/L PBS)；⑥洗涤液(含0.05％Tween20的10mmol/L PBS(pH 7.4))；⑦银增强液(组成见2.2)；⑧银溶出液(1∶3HNO₃(v∶v)溶液)；⑨化学发光反应液(组成见2.4)。ELISA 96孔板及反应板框架。

1.2制备黄曲霉毒素AFB₁标准溶液

用甲醇配成1mg/mL的AFB₁储备液，-20℃冰箱贮存，于检测当天，准确吸取储备液，用含20％甲醇的10mmol/L PBS(pH 7.0)稀释成制备标准曲线的所需浓度。

1.3制备AFB₁单克隆抗体溶液

用10mmol/L PBS溶解AFB₁单克隆抗体制备AFB₁单克隆抗体储备液，用时进一步稀释。

1.4纳米金的制备

(1)在圆底烧瓶中加入95.8mL超纯水，再加入4.2mL 1％的氯金酸溶液，磁力加热搅拌，持续煮沸10min。

(2)加入10mL 1％的柠檬酸三钠溶液(迅速)，溶液开始有些蓝色，然后变浅蓝色，再加热出现红色。

(3)等到出现透明的橙红色，停止加热，将热源除去，继续搅拌15min。

图2为所制备纳米金颗粒的紫外-可见吸收光谱，其最大吸收波长为520nm。

图3为所制备纳米金颗粒的透射电镜(TEM)图，可以看出纳米金形貌为较均一的球状，粒径在12nm左右，适合做蛋白标记物。

1.5纳米金标记AFB₁人工抗原复合物制备

取1mL纳米金于离心管中，加1.5mL溶于0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS)中的人工抗原于其中，充分混合。室温下放置1h，12000g离心45min，除去上清液后，加入1.5mL 1％BSA，重悬沉淀物，置冰箱4℃保存备用。

1.6制备抗体包被酶标板