[发明专利]染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用

权利要求书

1.染色体无标记随机整合载体pUTTns，其特征在于，由以下方法构建而成的：

分别取含质粒pUT mini-Tn5和pWSMK的大肠杆菌，划线于含50mg/kg卡那霉素和 100mg/kg氨苄青霉素的LB平板和含50mg/kg卡那霉素的LB平板，37℃培养24h，分 别挑单菌入含相应抗生素的LB液体试管，37℃150rpm培养18h，碱裂解法提取质粒 pUT mini-Tn5和pWSMK，用限制性内切酶SacI对质粒pUT mini-Tn5进行单酶切，回收 片段；

采用PCR扩增的方法从pWSMK中扩增出SacB基因并在其两端引入酶切位点SacI， 酶切酶连将SacB基因整合进pUT mini-Tn5的SacI酶切位点中，挑选阳性克隆命名为 pUTTnSacBs；

将pUTTnSacBs用SphI和NotI双酶切，回收大片段，采用PCR扩增的方法从 pUTTnSacBs中扩出SacB基因的前四百个碱基，命名为SacBq400，两端引入酶切位点 SphI和NotI，同时在NotI酶切位点前引入多克隆位点ApaI、NcoI、NdeI、AcccIII、EcoO109、 PspOMI和BspEI，酶切酶连将SacBq400整合入pUTTnSacBs，转化E.coli DH5α λpir， 即为构建成功pUTTnsKm；

将pUTTnsKm用MluI酶切，将卡那霉素抗性基因从pUTTnsKm中切开，回收大片 段，采用PCR扩增法获得氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，两端引入MluI限制性内 切酶酶切位点，通过酶切酶连，分别连入pUTTnsKm用MluI酶切回收的大片段中，转 化E.coli DH5α λpir，挑选阳性克隆即分别为pUTTnsCm和pUTTnsTet；

pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分别为含卡那霉素、氯霉素和四环素抗性基 因的整合载体系列，该载体通过同向序列的设计，可最终将抗性基因删除；pUTTnsKm 载体保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其宿主为大肠杆菌 Escherichia coli DH5αλpir，保藏号为：CGMCC 3098。

2.根据权利要求1所述的载体pUTTns，其特征在是：

pUTTnsKm和pUTTnsTet的多克隆位点含八个酶切位点ApaI、NcoI、NdeI、AcccIII、 EcoO109、PspOMI、BspEI、NotI，载体pUTTnsCm的多克隆位点含七个酶切位点ApaI、 NdeI、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、NotI，在载体抗性基因的两端有MluI酶切位 点可以针对不同的G^-细菌进行抗性基因的置换。

3.根据权利要求1或2所述的载体pUTTns，其特征在是：

载体pUTTns的宿主菌为原核生物大肠杆菌E.coli DH5α λpir，分别为：E.coli DH5α  λpir-pUTTnsCm、E.coli DH5α λpir-pUTTnsTet和E.coli DH5α λpir-pUTTnsKm。