[发明专利]染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用，是将外源目的基因随机整合到革兰氏阴性细菌的染色体上，再将抗性基因删除，得到不带有外源抗性的工程菌株的系列新载体，包括pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet，属于生物工程技术领域。 

二、背景技术

基因工程菌的应用非常广泛，在工业生产、制药、污染降解等方面得到了广泛的研究与应用，构建基因工程菌的方法主要有质粒转移法和基因改造法。由于质粒的不稳定性会导致外源基因和尤其是抗生素抗性基因的迁移，将外源基因构建于质粒载体而获得的基因工程菌的应用越来越受到限制。公众对基因工程微生物的环境释放的生态安全性也表示担忧，许多国家(如美国的EPA、中国转基因安全办等)对基因工程微生物环境释放进行了严格的限制。美国环境保护署花了2年时间评估才批准含有萘代谢质粒(pUTK21)的工程菌株P.fluorescens HK44应用于生物修复的田间试验。表达阿特拉津脱氯酶AtzA重组E.coli被戊二醛灭活后才被批准应用于阿特拉津污染土壤的生物修复。将外源基因整合到受体菌染色体上的常用的方法主要有同源重组和转座子插入等。同源重组必须要有同源序列才能进行整合，对一些遗传背景不明的菌株操作困难。转座子随机插入在通常情况下是抗生素抗性基因被用作正筛选标记，但所获得的目标工程菌株的染色体上同时会被引入抗性标记基因，如Victor D L等开发了一种Tn5衍生的转座子。因此，引入的外源抗性基因需要进行删除来能够进行环境释放。因此，目前迫切需要发展能将外源基因整合到受体菌染色体上且不带入外源抗性基因的整合技术，构建生态安全型的基因工程菌株应用于实践。 

反向筛选标记(Counter-selectable marker)是首先利用自杀性载体将目的片段和反向筛选标记基因整合到目标菌株的染色体上(先采用抗生素抗性基因为正筛选标记)，然后将整合子传代培养，再通过一次单交换使抗生素抗性基因从染色体中删除，从而获得无标记的工程菌株。反向筛选标记基因的表达一般会抑制宿主菌的生长或致死，因此在添加诱导物的选择性平板上，只有那些发生了重组将抗性基因和反向筛选标记基因删除的菌株才可以生长，从而被筛选出来。在革兰氏阴性菌中，来自于枯草杆菌的反向筛选标记基因-果聚糖蔗糖酶基因sacB可以将蔗糖转换成大分子的果聚糖，并使其在阴性菌的周质空间大量积聚，从而阻止宿主菌与外界的物质传递与运输，最终导致宿主菌停止生长或死亡。因此，染色体上整合有sacB基因的整合子不能够在蔗糖平板上生长，只有那些发生了重组事件将sacB基因和抗性基因删除的菌株才会在添加了蔗糖的选择性平板上生长。现国际上已经有报道应用sacB基因作为同源重组的反筛选标记。本发明即利用sacB基因作为反向筛选标记，构建出系列染色体无标记随机整合载体pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet。 

三、发明内容

技术问题  本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，建立针对革兰氏阴性细菌的染色体随机整合技术体系，并利用同向重复序列(Direct Repeat)之间的重组删除抗性标记基因，使用该载体构建出能够表达外源基因且不带有抗性基因的工程菌株，为实际生产应用提供技术支持。 

技术方案 

1.染色体无标记随机整合载体pUTTns，是由以下方法构建而成的： 

分别取含质粒pUT mini-Tn5和pWSMK的大肠杆菌，划线于含50mg/kg卡那霉素100mg/kg氨苄青霉素的LB平板和含50mg/kg卡那霉素的LB平板，37℃培养24h，分别挑单菌入含相应抗生素的LB液体试管，37℃150rpm培养18h，碱裂解法提取质粒pUT mini-Tn5和pWSMK，用限制性内切酶SacI对质粒pUT mini-Tn5进行单酶切，回收片段； 

采用PCR扩增的方法从pWSMK中扩增出SacB基因并在其两端引入酶切位点SacI，酶切酶连将SacB基因整合进pUT mini-Tn5的SacI酶切位点中，挑选阳性克隆命名为pUTTnSacBs；