[发明专利]一种体外扩增调节性T细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种扩增细胞的方法，尤其是一种体外扩增调节性T细胞的方法，属于生物医学技术领域。 

背景技术

近半个世纪以来，免疫抑制药物显著延长同种异体移植物存活时间的同时，也由于自身的毒副作用、昂贵的价格及药物诱导的非特异性免疫抑制所引发的临床并发症等一系列严重问题，极大限制了临床器官移植的进一步发展。通过诱导移植物特异性免疫耐受或达到类似应用免疫抑制剂的“临床几乎耐受”状态，从而减少甚至不用免疫抑制剂，成为移植免疫学研究领域的基本课题之一。虽然许多研究者已在不同动物中成功地诱导了同种异体移植的免疫耐受状态，但由于目前尚不清楚的原因，至今尚未找到一种有效方法，能够在临床前期的大动物模型中重复这些实验成果，更谈不上应用于临床。因此发展有效诱导针对供体特异性免疫耐受的治疗策略已成为实验和临床研究的主要方向，其特点不仅仅是延长移植物的存活率，同时应最大限度消除免疫抑制剂非特异性广泛抑制的缺点^[1]。国内外学者一直在寻求可以替代免疫抑制药物的途径^[2-4]。如：(1)阻断共刺激通路：虽然在移植动物模型中，通过阻断协同刺激通路使同种移植物存活时间明显延长，但该方法并不能达到持续稳定的耐受。(2)非成熟的异体树突状细胞(DC)：目前体外诱导产生的非成熟的DC在某些情况下诱导体内外抗原特异性T细胞无反应，体内输注能明显延长同种异体移植物的存活，但只能获得短期的耐受。(3)混合性嵌合：大量实验研究进展说明，混合性嵌合诱导免疫耐 受已经非常接近于临床应用，但一个关键的问题就是供者细胞输注，会诱发移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。上述措施并未达到令人满意的效果。同时又有研究表明上述途径诱导免疫耐受的机制与继发性诱导CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)有关。 

1995年Sakaguchi等研究发现小鼠被祛除CD4+CD25+调节性T细胞会引发多种自身免疫性疾病，而将这些调节性T细胞回输则可抑制疾病的发生^[5]。在正常人和小鼠的外周血及淋巴组织中的CD4+T细胞中约有5％～10％的细胞持续高表达CD25分子(IL-2受体α链)，同时这一亚群细胞是CD45RB分子低表达的。调节性T细胞亚群由胸腺或由外周活化的细胞发展而来，其T细胞受体(TCR)的表达不同于常规T细胞，与常规CD4+T细胞一起在外周与特异性抗原发生反应。胸腺产生的CD4+CD25+调节性T细胞进入外周后需要外周自身抗原的刺激等多种因素的影响才能成为功能性调节性T细胞。胸腺上皮细胞对CD4+CD25+调节性T细胞的分化可能起着主要作用，抗原提呈细胞(APCs)特别是树突状细胞(DCs)的成熟或活化对CD4+CD25+调节性T细胞的功能发挥调节作用^[6]。其中，转录因子Foxp3是该调节性T细胞的特征性标记，是调节性T细胞发育和功能的特异性转录因子，CD28及其信号通路，IL-2和IL-2受体信号途径等均是其生存所必须的信号分子。转导Foxp3基因到CD4+和CD8+细胞均能使它们转变为调节性T细胞^[7，8]。CD4+CD25+调节性T细胞已证实具有控制I型糖尿病和预防造血干细胞的急性GVHD^[9，10]。在同种异体器官移植中已证明了它潜在的对移植物的保护作用^[11，12]。但是，目前有关调节性T细胞的应用仍受到以下条件的限制^[13-17]：1)自然产生的调节性T细胞(天然Treg)数量少。天然Treg在动物体内约占胸腺和外周血CD4+的5％～10％，而在正常人体中仅仅1-2％的CD25bright细胞具有免 疫抑制功能。因此，缺乏足够数量的Treg制约着临床的应用的可行性；2)扩增后表型和抑制功能可能发生改变。虽然通过体外扩增有可能克服细胞数量的问题，但是，最近有报道显示，体外多轮扩增的Treg失去了免疫抑制能力，并且多克隆扩增的Treg并不能对人造血干细胞移植后的GVHD产生防治作用，同时也发现Treg在一定条件下可向效应T细胞转化；3)自然Treg一旦被抗CD3单抗或PHA等广泛激活，其介导的抑制功能没有抗原特异性，即它们既可抑制具有相同抗原特异性的T细胞，也可抑制对其他抗原特异性的T细胞；4)在致炎因子IL-6等的诱导下，天然Treg细胞能够转化成为Th17细胞。Th17细胞是一类产生IL-17A和IL-17F的Th细胞亚群。IL-17属于促炎因子，与许多炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展有关。此外，Th17细胞也与移植的排斥反应有密切关系。目前研究已证实TGF-β和IL-6联合使用能使活化的原始CD4+T细胞分化为Th17，由于Treg细胞表达或者产生TGF-β，在存在高水平的IL-6的情况下，天然的Treg细胞本身能够转化成为Th17细胞。这样，在炎症和移植排斥的环境下，因为伴有高水平的IL-6，使用天然的Treg细胞实际上有一定恶化疾病的风险。除了天然Treg外，胸腺外诱导产生的CD4+CD25+调节性T细胞(iTreg)对免疫平衡和自稳也起了重要的作用。目前iTreg中以TGF-β诱导的调节性T细胞最受重视，但是体外诱导的人的Foxp+T细胞具有调节细胞的表型，缺乏免疫抑制功能^[18]。