[发明专利]一种体外扩增调节性T细胞的方法

权利要求书

1.一种体外扩增调节性T细胞的方法，包括以下步骤：

第一步、采用：采用肝素抗凝常规采血手段采集的血液；

第二步、分离：从采用的血液中离心分离出外周血淋巴细胞，再由外周血淋巴细胞分离得到原始CD4+T细胞；

第三步、培养：将原始CD4+T细胞置于培养基中，在37℃±5℃、5％±1％CO₂的条件下，培养7-10天；所述培养基由完全RPMI-1640培养基中添加青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、2mM左旋谷氨酸、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和50μM二羟基乙醇配制而成；

第四步、诱导：对培养后的原始CD4+T细胞进行刺激，并加入诱导剂培养原始CD4+T细胞，直至细胞密度扩增至初始培养浓度的10倍，停止诱导，即得调节性T细胞；刺激的方式为T细胞表面受体刺激，通过anti-human-CD3CD28磁珠进行T细胞表面受体刺激，磁珠与T细胞比例为1∶10；所述诱导剂包括100IU/mL的rhIL-2、5ng/ml的rhTGF-β和10nM的Rapamycin，其中rhIL-2加入后最终浓度为100IU/mL，rhTGF-β加入后最终浓度为5ng/mL，Rapamycin加入后最终浓度为10nM；

第五步、扩增：由调节性T细胞中分选出CD4+CD27+T细胞，移入含有10ng/mL anti-humanCD3的细胞培养板中，加入扩增剂持续刺激，培养至细胞扩增达到10倍，收集细胞，向其中每10⁶个细胞加入1μl的anti-hCD4-PE抗体和每10⁶个细胞加入1μl的anti-hCD27-FITC抗体，再分选得到扩增后的CD4+CD27+调节性T细胞；所述扩增剂为下列二者之一：

(A)所述扩增剂由20IU/ml的rhIL-2、10nM的Rapamycin和1ng/ml的anti-human CD28配制而成；其中，rhIL-2加入后最终浓度为20IU/mL，anti-human CD28加入后最终浓度为1ng/ml，Rapamycin加入后最终浓度为10hM；或者，

(B)所述扩增剂为辐照后的异体树突状细胞，所述异体树突状细胞在辐照前与抗原肽混合培养3-5小时。

2.根据权利要求1所述体外扩增调节性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤五中，在细胞培养期间，每三天将原有的细胞分为两个孔，同时向每个培养孔中加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基至总体积为1毫升。

3.根据权利要求1所述体外扩增调节性T细胞的方法，其特征在于：所述步骤五中扩增后的细胞在没有任何刺激的环境下休整48小时。