[发明专利]耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌的培养方法，特别是一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法。

背景技术

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)是生产有机肥料的重要菌种，能够应用于微生物钾肥的生产，促进经济作物的生长。但该菌的耐盐行较差，在较高盐浓度的培养基中生长受到显著抑制。因此在盐碱性土壤中生长活性较差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法简单、可操作性强的耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，该方法能培养得到耐盐性高的胶质芽孢杆菌。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其特点是，其步骤如下：

(1)将胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；

(2)用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至10³～10⁵万个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；

(3)取诱变菌体进行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下：

1)用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至10²～10³万个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100～200μl；

2)25～32℃培养5～7天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，选取96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛；

3)将吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至10²～10³万个/ml，取100～200μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，25～32℃培养3～5天，重复3～5次，出现黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行2～3次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌。

在本发明技术方案中所涉及的各培养基如下：

1、无氮培养基：

甘露醇5.0～10.0g；K₂HPO₄0.5～2.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5g；琼脂粉15.0～20.0g；蒸馏水1000ml；pH为7.0～7.5。

2、抑制荚膜生长的液体培养基：

麦芽糖：10.0～20.0g；(NH₄)₂SO₄0.5～2.0g；酵母粉0.1～1.0g；MgSO₄·7H₂O0.2～1.0g；K₂HPO₄0.5～2.0g；蒸馏水1000ml，pH为7.0～7.5。

3、筛选培养基：

蔗糖5.0～10.0g，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH为7.0～7.5。

4、复筛培养基：

蔗糖5.0～10.0g，琼脂粉15.0～20.0g；溴酚蓝或甲基红指示剂0.002～0.005g·L-1，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH7.0～7.5。

本发明步骤(2)所述的辐射诱变或者化学诱变的诱变方法可以采用常规的诱变方法。

本发明还可以按照上述步骤(2)、(3)循环进行四～五级诱变、筛选、复筛，获得在不同浓度的海水或者含钾卤水中保持活力的耐盐性胶质芽孢杆菌；其中：

一级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶100；

二级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶25；

三级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶10；

四级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶5；

五级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶1。