[发明专利]土壤中病原细菌的多重PCR检测方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种用于土壤中病原细菌检测的多重PCR扩增方法，具体涉及多 重PCR检测方法在被大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(salmonella)、金 黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginos)污染的土壤样品分析中的应用。

二、背景技术

快速检测与鉴定土壤环境中的病原菌是及时有效地控制与预防病原菌传播的 前提，对人类健康具有重要意义。目前对病原细菌的检测方法，主要依靠常规 的细菌学培养方法，一般需4～7d，操作繁琐，费时耗力；有关病原细菌检测的 乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定方法、核酸杂交技术和PCR技术因其 特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用，但这些方法每 次实验通常只能检测一种病原细菌。本发明主要基于通用靶标gyrB基因的PCR扩 增技术和多重PCR扩增技术快速检测土壤中的5种典型病原菌：致病性大肠杆菌、 伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌，达到一次性、同 时、快速检测出多种土壤病原菌的目的。

本发明所筛选的各病原菌基因均具有较强的特异性和灵敏性。大肠杆菌phoA 基因是其持家基因，存在于所有大肠杆菌中；沙门氏菌的ttrBCA基因编码的是连 四硫酸盐还原酶结构蛋白，沙门氏菌基因组中较为保守的序列；金黄色葡萄球菌 vicK基因只存在于金黄色葡萄球菌中，在其它葡萄球菌和病原菌中均检测不出； 志贺氏菌的ipaH基因存在于所有志贺菌属的质粒和染色体上，具有高度特异 性，比其他毒力因子ipaB、C、D基因有更高的灵敏度，是侵袭力的特异标志； 志贺氏菌的virA基因存在于所有志贺氏菌和侵染性大肠杆菌(EIEC)中，具有较 高的特异性和灵敏度，目的条带为215bp；铜绿假单胞菌的ecfX基因是有关血红 素或毒性的基因。本发明筛选合成这6对特异性引物通过不同的组合进行多重 PCR扩增检测，以达到快速检测土壤样品中病原菌的目的。

三、发明内容

技术问题：本发明目的在于克服常规病原菌检测技术操作繁琐，费时耗力等 不足，充分发挥多重PCR技术在土壤病原菌检测中的应用，尽量增加病原菌的种 类和引物的对数，提高检测的特异性和灵敏度。

技术方案：一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，采用多重PCR一次 性同时扩增致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和福氏 志贺菌的特异性基因：phoA、ttrBCA、vicK、ecfX、ipaH和virA，再通过琼脂糖 凝胶电泳检测PCR扩增产物。

一种多重PCR快速检测方法，所述多重PCR扩增土壤中病原菌特异性基 因，包括如下步骤：

(1)土壤样品的采集及预处理：取距离土层表面1～5cm的土壤，装入灭菌封 口塑料袋中，去除样品中带有的植物残体、沙石等大颗粒，研磨过20目筛， -80℃保存备用；

(2)DNA模板提取：

①取步骤1预处理过的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取 仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA；

②取未被病原菌污染的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取 仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA；

(3)多重PCR扩增检测土壤中病原菌的毒素基因、高度保守性基因及特异 性基因phoA、ttrBCA、vicK、virA或ipaH、ecfX，具体步骤如下：

反应体系：总体系30μL

H₂O                    9.5μL；

缓冲液(10×PCR)        3.0μL；

MgCl₂(25mM)            1.5μL；

dNTP(2.5mM)            2.5μL；

phoA正向(10μmol/L)    0.5μL，

phoA反向(10μmol/L)    0.5μL；

ttrC-13(10μmol/L)     2μL，

ttrB-1(10μmol/L)      2μL；

vicK1(10μmol/L)       1.5μL，

vicK2(10μmol/L)       1.5μL；