[发明专利]土壤中病原细菌的多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时 扩增致病性大肠杆菌phoA、沙门氏菌ttrBCA、金黄色葡萄球菌vicK、铜绿假单胞菌ecfX、 和福氏志贺菌的特异性基因ipaH或virA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，其 中引物为：

致病性大肠杆菌引物为：

phoA正向：5′-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3′，

phoA反向：5′-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3′；

沙门氏菌引物为：

ttrC-13：5′-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3′，

ttrB-1：5′-CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3′；

金黄色葡萄球菌引物为：

vicK1：5′-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3′，

vicK2：5′-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3′；

福氏志贺菌引物为：

virA-F：5′-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3′，

virA-R：5′-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3′；或

ipaH-U1：5′-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3′，

ipaH-L1：5′-CGGAATCCGGAGGTATTGC-3′；

铜绿假单胞菌引物为：

ECF1：5′-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3′，

ECF2：5′-TCATCCTTCGCCTCCCTG-3′。

2.一种如权利要求1所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增 土壤中病原菌特异性基因，包括如下步骤：

(1)土壤样品的采集及预处理：取距离土层表面1～5cm的土壤，装入灭菌封口塑料袋中， 去除样品中带有的植物残体、沙石等大颗粒，研磨过20目筛，-80℃保存备用；

(2)DNA模板提取：

①取步骤1预处理过的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取仪提取和纯 化土壤中的细菌总DNA；

②取未被病原菌污染的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取仪提取和纯 化土壤中的细菌总DNA；

(3)多重PCR扩增检测土壤中病原菌的毒素基因、高度保守性基因及特异性基因phoA、 ttrBCA、vicK、virA或ipaH、ecfX，具体步骤如下：

反应体系：总体系30μL

H₂O                  9.5μL；

缓冲液10×PCR        3.0μL；

MgCl₂25mM            1.5μL；

dNTP 2.5mM           2.5μL；

phoA正向10μmol/L    0.5μL，

phoA反向10μmol/L    0.5μL；

ttrC-13 10μmol/L    2μL，

ttrB-1  10μmol/L    2μL；

vicK1   10μmol/L    1.5μL，

vicK2   10μmol/L    1.5μL；

virA-F  10μmol/L    1μL，

virA-R  10μmol/L    1μL；或

ipaH-U1 10μmol/L    1μL，

ipaH-L1 10μmol/L    1μL；

ECF1  10μmol/L      1μL，

ECF2  10μmol/L      1μL；

模板DNA              1μL，

TaqDNA聚合酶5U/μL   0.5μL；

引物：

致病性大肠杆菌引物为：

phoA正向：5′-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3′，

phoA反向：5′-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3′；

沙门氏菌引物为：

ttrC-13：5′-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3′，

ttrB-1：5′-CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3′；

金黄色葡萄球菌引物为：

vicK1：5′-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3′，

vicK2：5′-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3′；

福氏志贺菌引物为：

virA-F：5′-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3′，

virA-R：5′-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3′；或

ipaH-U1：5′-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3′，

ipaH-L1：5′-CGGAATCCGGAGGTATTGC-3′；

铜绿假单胞菌引物为：

ECF1：5′-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3′，

ECF2：5′-TCATCCTTCGCCTCCCTG-3′；

(4)PCR反应循环参数如下：

95℃5min；以95℃1min，55℃1min，72℃1min为1个循环，共进行30个上述循环； 72℃10min；10℃保存；

(5)电泳检测鉴定：

对多重PCR反应产物进行电泳检测，电泳图中含有622bp、528bp、418bp、289bp、112bp 或215bp相应目的条带的一种或多种，分别对应于样本中的致病性大肠杆菌phoA基因、铜绿 假单胞菌ecfX基因、沙门氏菌ttrBCA基因、金黄色葡萄球菌vicK基因、福氏致贺菌ipaH基 因或virA基因的一种或多种。