[发明专利]利用迷你内含子蛋白介导人胰高血糖素样肽(GLP-1)的制备

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，通过迷你内含子蛋白intein介导多肽人胰高血糖素样肽(GLP-1)的制备，制备多肽GLP-1的过程中不需要蛋白酶的参与，并且多肽GLP-1具有天然N端。

背景资料

蛋白质内含子(intein)是指前体蛋白中的一段插入序列，在蛋白质翻译后的成熟过程中它能自我催化蛋白质的剪接作用(protein splicing)，使自身从前体蛋白中切除，并将其两侧称为蛋白质外显子(extein)的多肽片段以正常的肽键连接形成有功能的成熟蛋白。

各种蛋白质内含子的氨基酸序列有一定的同源性，大部分蛋白质内含子是由N-端和C-端的剪接结构域(splicing domain)以及中间的核酸内切酶(endonuclease domain)组成。这些结构域由一些保守区域或基序组成。在目前所发现的蛋白质内含子中，约有15％的蛋白质内含子缺失核酸内切酶结构域，称为微型蛋白质内含子(mini-intein)。由于核酸内切酶结构域通常不参与蛋白质内含子的剪接过程，因此可以采用基因突变删除核酸内切酶结构域并将蛋白质内含子改造为微型蛋白质内含子。例如在Synechocystic Sp.PCC6803菌的DNA旋转酶中发现的Ssp DnaB蛋白质内含子由429个氨基酸组成，保留其N-末端的106个和C-末端的48个氨基酸，删除其由275个氨基酸组成的核酸内切酶结构域，由此形成的Ssp DnaB微型蛋白质内含子具有完整的剪接功能。

蛋白质内含子N-端和C-端剪接区的功能具有相对独立性，当N-端的Ser、Cys或Thr突变后，N-端的剪切功能丧失，但C-端的剪切功能仍保留；同样，当C-端的Asn突变后，N-端的剪切功能仍然存在。因此对蛋白质内含子引入适当的突变，就可获得N-端和C-端切割元件。如果将C-端切割元件与亲和标签及目的蛋白基因放置在同一个阅读框架内可获得融合蛋白。分别利用大肠杆菌系统表达出融合蛋白与N-端切割元件蛋白，并在体外将融合蛋白与N-端蛋白按一定比例混合，改变溶液的pH值和温度，就可发生蛋白内含子介导的拼接作用，使目标蛋白从融合蛋白中切割下来，释放出具有游离N-端的目标蛋白，而不需要另外使用蛋白酶处理。

GLP-1是一种肠道分泌的肽类激素，主要由末端空肠，回肠和结肠的L细胞所分泌。它来源于胰高血糖素原，是其在肠道L细胞中翻译后的加工产物，再被酶解去掉N端的6肽和C端酰胺化即可生成具有高度活性的GLP-1(7～36)(NH₂)，其序列在目前已研究的哺乳动物中均相同。GLP-1(7～36)(NH₂)是人体内GLP-1的自然形式，它主要是通过与G蛋白偶联的受体结合来发挥生理功能。GLP-1不仅能葡萄糖依赖性地作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，胰岛素的合成和分泌，还能刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡。GLP-1与磺脲类药物相比还有如下优势：增加葡萄糖敏感的β细胞的数量；改善患者对胰岛素的敏感性；无低血糖危害，当血糖低于4-5mmol/L时就不促进胰岛素分泌。另外GLP-1可直接降低血糖，对完全丧失胰岛素分泌功能的1型糖尿病患者也有治疗作用。由此可见GLP-1从多个角度发挥其功能，使其在治疗糖尿病方面具有诱人的前景。

发明内容：

本发明目的是提供一种由微型蛋白内含子intein介导的成本低、效果好的制备重组人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的方法。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

编码重组人胰高血糖素样肽-3的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述，该序列含有大肠杆菌偏爱密码子，适合用大肠杆菌进行表达制备重组蛋白。

利用SEQ ID NO.3生产重组人胰高血糖素样肽-1的方法，包括下列步骤：

a.在DNA水平，将含有SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.6的双链DNA通过重叠PCR的方法连接后，与含有组氨酸标签编码基因的表达载体pET28a连接，形成intein C与胰高血糖素样肽-1融合蛋白表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌，经诱导，该大肠杆菌表达产生inteinC与胰高血糖素样肽-1融合蛋白(inteinC-GLP)，inteinC-GLP中的胰高血糖素样肽-1为重组人胰高血糖素样肽-1(含天然胰高血糖素样肽的第7位至36位氨基酸)；