[发明专利]利用迷你内含子蛋白介导人胰高血糖素样肽(GLP-1)的制备

权利要求书

1.通过迷你内含子蛋白(intein)介导胰高血糖素样肽的制备。

2.intein的C端48个氨基酸组成的结构域与胰高血糖素样肽-1形成融合蛋白，该融合蛋白在intein的N端106个氨基酸组成的结构域作用下进行剪接，得到胰高血糖素样肽-1。

3.intein C端48个氨基酸的结构域与胰高血糖素样肽-1形成融合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所述。

4.intein C端与胰高血糖素样肽-1形成融合蛋白的核苷酸序列插入到载体pET28a中所构建的表达载体pET28a-inteinC-GLP。

5.表达载体pET28a-inteinC-GLP转化大肠杆菌BL21后的菌种。

6.intein N端结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所述。

7.利用权利要求3、4所述核苷酸序列生产胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于包括下列步骤：

a、在DNA水平，将编码含有SEQ ID NO.3与编码含有SEQ ID NO.6的DNA通过重叠PCR的方法连接，并将双链DNA与表达载体连接，形成intein C-胰高血糖素样肽-1融合蛋白表达质粒。用该表达质粒转化宿主菌，经诱导，该宿主菌表达产生融合蛋白。

b、在DNA水平，将编码含有SEQ ID NO.4的双链DNA与表达载体连接，形成intein N的表达质粒。用该表达质粒转化宿主菌，经诱导，该宿主菌表达产生intein N蛋白。

c.将上述intein C-胰高血糖素样肽-1的融合蛋白与intein N按1.4∶1的摩尔比混匀，于pH6.2的磷酸盐缓冲液中进行拼接反应。拼接产物过Ni-sepharose进行亲和纯化，胰高血糖素样肽-1存在于穿过液中，经反相高效液相色谱进一步纯化后，进行性质鉴定。