[发明专利]细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用，用于活细胞计数，直接检测细胞增殖的测定方法，也是一种评价药物、多肽生长因子等物质细胞毒性的检测方法，适用于细胞培养板中培养的悬浮和贴壁细胞的检测。

背景技术

细胞增殖检测的传统方法因为放射性污染、操作繁琐、灵敏度低、仪器设备要求高、费用昂贵等原因而逐步被替代。目前广泛应用于细胞增殖检测的是四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应测定。在20世纪60年代，科学家发现MTT可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色甲月赞产物，并认为其有反映活细胞的生存和增殖的潜在价值，于1983年确认了MTT法是正确评价细胞增殖和存活情况的一种客观指标。被美国NCI选作为体外抗癌药物筛选的常规方法。20世纪90年代以来，MTT法以其简便、快速、易标准化、不使用同位素等优点，从众多药敏试验方法中脱颖而出，其药敏结果指导临床治疗胃癌、结肠、直肠癌与消化道肿瘤均取得良好效果。

随后研究者对MTT进行了各种实验改进，出现了MTT的衍生物XTT，可形成水溶性甲月赞(Formazan)产物，由此省略了常规MTT法中需加酸化异丙醇溶解甲月赞的步骤。但XTT法本身不稳定，相对难溶，需要新鲜配制，而且XTT法形成的甲月赞产物为桔黄色，培养体系中一些黄色代谢物和试剂均可影响检测结果；因此又设计出一种新型的MTT类似物MTS，MTS在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的条件下，可被活细胞还原形成水溶性的甲月赞产物。与XTT法相比具操作简便，特异性强，形成的甲月赞产物为深棕色，检测时外部因素影响少；随后又出现了灵敏度更高的2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二硫代苯)-2H-四唑盐(WST-1)，同样在PMS存在的条件下进行脱氢酶反应形成水溶性的甲月赞产物，但WST-1溶液和PMS粉末需要单独配置，使用时进行比例混合，操作比较繁琐；目前市场公认的无论是检测灵敏度还是操作简易程度最佳的是2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐(WST-8)，一种新型的四氮唑盐，与WST-1作用条件一样，需要PMS的存在。以WST-8为试剂配置主要成分，国内外出现了众多基于WST-8的细胞增殖检测试剂盒，但普遍存在的问题是1.试剂存放有效期短，容易造成浪费；2.检测灵敏度相比较传统³H掺入法还有待提高；3.显色反应结束后没有终止反应液进行终止反应，需要自行选择配置，给实验带来不便，导致检测时间重复性差。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有产品的不足之处，提供一种细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用，以WST-8为主要成分配方的细胞增殖检测试剂盒，应用于活细胞计数、细胞增殖和细胞毒性的检测，能有效提高其有效使用期和检测灵敏度，避免不必要的浪费。

细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用是采取以下方案实现：

细胞活力检测试剂盒由WST-8混合溶液储存液、反应终止液、缓冲稀释液组成。其中WST-8混合溶液储存液包含有50mmol/L WST-8溶液、2mmol/L PMS、1mol/L PIPES缓冲液；反应终止液为10％(W/V)十二烷基磺酸钠；缓冲稀释液为1mol/L PIPES溶液。

细胞活力检测试剂盒的制备方法：

(1)1mol/L PIPES缓冲液的配置

按配比称取PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))自由酸，溶解于去离子水中，用NaOH调节PH至6.9，加去离子水定容至1mol/L，微孔滤器过滤除菌，4℃保存备用；

(2)WST-8混合储存液的配置

按配比分别称取WST-8粉末，PMS粉末，溶解于1mol/L PIPES缓冲液中，混合均匀，微孔滤器过滤除菌，4℃避光保存；

(3)反应终止液的配置

按配比称取十二烷基磺酸钠溶解于去离子水中，搅拌均匀，配置成10％(W/V)的十二烷基磺酸钠溶液，4℃保存备用；

(4)试剂盒的组装过程

将上述配置的溶液，以10ml、100ml或500ml规格无菌操作分装于试剂瓶中，组成细胞活力检测试剂盒；