[发明专利]细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用

权利要求书

1、一种细胞活力检测试剂盒，其特征在于由WST-8混合溶液储存液、反应终止液、缓冲稀释液组成，其中WST-8混合溶液储存液包含有50mmol/L WST-8溶液、2mmol/L PMS和1mol/L PIPES缓冲液；反应终止液为10％(W/V)十二烷基磺酸钠；缓冲稀释液为1mol/L PIPES溶液。

2、权利要求1所述的细胞活力检测试剂盒的制备方法，其特征在于：

(1)1mol/L PIPES缓冲液的配置

按配比称取PIPES自由酸，溶解于去离子水中，用NaOH调节PH至6.9，加去离子水定容至1mol/L，微孔滤器过滤除菌，4℃保存备用；

(2)WST-8混合储存液的配置

按配比分别称取WST-8粉末，PMS粉末，溶解于1mol/L PIPES缓冲液中，混合均匀，微孔滤器过滤除菌，4℃避光保存；

(3)反应终止液的配置

按配比称取十二烷基磺酸钠溶解于去离子水中，搅拌均匀，配置成10％(W/V)的十二烷基磺酸钠溶液，4℃保存备用；

(4)试剂盒的组装过程

将上述配置的溶液，以10ml、100ml或500ml规格无菌操作分装于试剂瓶中，组成细胞活力检测试剂盒；

其中WST-8混合溶液储存液包含有50mmol/L WST-8溶液、2mmol/L PMS和1mol/L PIPES缓冲液；反应终止液为10％(W/V)十二烷基磺酸钠；缓冲稀释液为1mol/L PIPES溶液。

3、根据权利要求1或2所述的细胞活力检测试剂盒，其特征在于所述的WST-8为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐。

4、权利要求1或2所述的细胞活力检测试剂盒应用于活细胞计数、细胞增殖和细胞毒性的检测。

5、根据权利要求4所述的细胞活力检测试剂盒应用于活细胞计数、细胞增殖的检测使用流程：

(1)取生长状态良好的细胞制备成一定细胞浓度悬液，每孔100μl加入96孔细胞培养板中，如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-4小时，如果是悬浮细胞，则不需要预培养；

(2)将试剂盒中WST-8混合溶液储存液按照需要用量，在稀释瓶中使用1mol/L PIPES进行1∶10稀释，备用；

(3)将稀释瓶中的溶液按照每孔10μl加入96孔细胞培养板，37℃培养箱培养1-4小时；

(4)显色反应后，加入10％(W/V)十二烷基磺酸钠每孔10μl终止反应，酶标仪上450-490nm测光吸收度，每份样本做三个重复孔，将不含细胞，只加入培养基和试剂的孔作为空白对照孔，所测每孔的吸光度OD值可间接反应每孔中的细胞数，以一组细胞数梯度为X轴，吸光度OD值为Y轴，作回归曲线，可根据OD值推算每孔细胞数。

6、根据权利要求4所述的细胞活力检测试剂盒应用于活细毒性的检测使用流程：

(1)取生长状态良好的细胞制备成一定细胞浓度悬液，每孔100μl加入96孔细胞培养板中，如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-4小时，如果是悬浮细胞，则不需要预培养；

(2)加入不同浓度的毒性物质，37℃培养箱进行培养，时间根据毒性物质的性质和细胞的敏感性确定；

(3)将试剂盒中WST-8混合溶液储存液按照需要用量，在稀释瓶中使用1mol/L PIPES进行1∶10稀释，备用；

(4)将稀释瓶中的溶液按照每孔10μl加入96孔细胞培养板，37℃培养箱培养1-4小时；

(5)显色反应后，加入10％(W/V)十二烷基磺酸钠每孔10μl终止反应，酶标仪上450-490nm测光吸收度，每份样本做三个重复实验孔As，将不含细胞和毒性物质，只加入培养基和试剂的孔作为空白对照孔Ab；含有细胞的培养基和试剂，但不加毒性物质的孔作为阳性对照孔Ac；按照细胞存活率公式：细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100％计算出细胞存活率，按照细胞存活率反应出被检测物质的细胞毒性。