[发明专利]一种用于制备siRNA的氟代寡核苷酸的合成方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物有机合成技术领域，涉及用于制备siRNA的氟代寡核苷酸(FANA)的生物有机合成方法。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。它的形成是由多基因突变累积与相互作用形成导致的。从1998年发展起来的RNA干扰技术，是由siRNA介导的高度特异的转录后基因沉默效应，具有高效性，特异性的特点(Andrew Fire，et al.Nature，1998，391：806-811)。现已发展成为一种成熟的抑制靶基因表达的有力工具，尤其是对于由基因转录水平增加而导致的基因过度表达是一种强有力的抑制手段(Xia Haibin，et al.Nature，2002，20：1006-1010)。RNA干扰应用于肿瘤治疗目前主要的障碍是转运途径的问题，目前解决这个问题的最有效的途径有两个：1、化学修饰siRNA，使其具备更好的核糖核酸酶抗性，从而提高其生物稳定性，增加其生物利用度；2、应用病毒载体表达shRNA，从而使被感染细胞内能够较为容易的表达shRNA。其它的如脂质体等转染试剂帮助siRNA或shRNA表达载体转运也是很有希望的途径(Arndt B.Cancer cell，2002，2(3)：167-168)。siRNA在体内环境的生物稳定性很差。实验表明，没有经过修饰的siRNA在血清中的半衰期小于15分钟，这极大的限制了siRNA在临床治疗中的应用。为解决该项技术的缺陷，目前研究已经证实，经过化学修饰后的siRNA能在保留原有生物活性的基础之上，进一步提高体内的稳定性，其在血清中的半衰期可以增加数十倍，具备了临床治疗应用的潜力(Elbashir SM，et al.Nature.2001；411：494-498)。文献报道的化学修饰RNA方法较多，主要分为核糖核酸的末端和化学基团修饰、核苷酸的骨架修饰或2’-、4’-位修饰、碱基修饰、组合修饰等等。硫代磷酸的修饰是第一代的核酸修饰方法，其产物抗核酸酶解能力较强，但是有较大的非特异毒性。核糖的2位羟基的烷基修饰是第二代的核酸修饰法，其重要代表是2’-O-methyl(OMe)和2’-O-methoxy-ethyl(MOE)RNA。其产物在性能上虽有一定改善，但非特异毒性依然存在。在这个基础上，发展了许多各式各样的修饰方法，主要有Peptide nucleic acids(PNAs)、N3’-P5’phosphoroami dates(NPs)、’-Deoxy-2’-fluoro-b-D-arabino nucleic acid(FANA)、Locked nucleic acid(LNA)、Morpholinooligonucleotides(MF)、Cyclohexene nucleic acids(CeNA)、Tricyclo-DNA(tcDNA)等方法，称之为第三代的核酸修饰法(Xiaolan Chen，et al.Drugdiscovery todaytargets，2005，10(8)：587-593)。

FANA(2’-Deoxy-2’-fluoro-b-D-arabino nucleic acid，2’-脱氧-2’-氟-b-D-阿拉伯糖核苷酸)修饰的RNA是指由FANA替代核糖组成寡核苷酸的骨架形成的RNA类似物。

近几年的文献已证实，FANA修饰是极少数的能够增强siRNA血清中半衰期的同时还能增强siRNA的活性的方法之一(Chiu YL，et al.RNA，2003，9(9)：10341048)。但目前尚未见到该方法修饰的siRNA应用于肿瘤治疗的报道。采用FANA修饰法对siRNA进行恰当的修饰，既能保留甚至增强其生物学活性，又能显著增加其生物学稳定性，是一种很有前景的siRNA修饰方案。本发明提供了一种用于制备siRNA的氟代寡核苷酸的合成方法。

发明内容

本发明通过下述方法实现的：本发明涉及用于制备siRNA的氟代寡核苷酸(FANA)的合成方法如下：

①以1-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖为原料，二氯甲烷为溶剂，在酸性条件下，经重排反应，制备获得，以1，3，5-三-O-苯甲酰基-2-羟基-β-D-呋喃核糖，收率约70％。

②经三氟甲基磺酸酯取代活化，通过亲核取代(SN2)反应，利用氟化试剂进行氟代反应，获得关键中间体2-脱氧-2-氟-1，3，5-三-O-苯甲酰-β-D-阿拉伯糖。

③在氢溴酸乙酸的条件下，溴代反应制备1-溴-2-脱氧-2-氟-3，5-二-O-苯甲酰-β-D-阿拉伯糖。