[发明专利]一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)的表达和纯化，特别涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)的可溶性表达及纯化方法。属生物化学领域。

背景技术

RT-PCR作为重要的分子生物学研究手段，是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。由mRNA到cDNA的过程称为反转录，是由反转录酶(reversetranscriptase)催化反应的。反转录酶又称RNA指导的DNA聚合酶。是以RNA为模板合成DNA的酶，这种酶是1970年美国科学家特明(H.M.Temin)和巴尔的摩(D.Baltimore)分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。MMLV(来自Moloey鼠白血病病毒)是常用的反转录酶，是依赖于RNA的DNA聚合酶，有5’--3’DNA聚合酶活性。作为最常用的分子生物学产品，反转录酶(reverse transcriptase)市场需求量巨大，而天然反转录酶的提取技术复杂、产率低。目前，通过基因工程技术克隆的重组鼠白血病病毒逆转录酶在pET系统中表达量高，但是容易形成包涵体，纯化后只能得到很少量的活性蛋白。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，本发明通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下MMLV-RT与分子伴侣TF共表达，MMLV-RT蛋白的表达量可以提高到15％，而可溶性是常规方法表达的10倍。最后，利用六个组氨酸标签和肠激酶酶切来纯化得到逆转录酶(MMLV-RT)。

本发明是以如下技术方案实现的：一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是：通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温条件下与分子伴侣共表达，来提高蛋白的表达量和可溶性。

所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是：将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下与分子伴侣共表达。

所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是：将MMLV-RT基因克隆到pET28a载体中实现共表达。

所述的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是：将MMLV-RT和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中表达。

所述的MMLV-RT基因在低温条件下与分子伴侣共表达。

所述构建的表达载体为pET28a-His6-EK(肠激酶)-MMLV-RT。

所述表达的分子伴侣为TF和GroEL-GroES，MMLV-RT与分子伴侣TF、GroEL-GroES在宿主菌中共表达。

所述表达融合蛋白含六个组氨酸标签，用Ni-NTA纯化融合蛋白。

所述表达的一种重组鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化方法，其特征是：通过Ni-NTA纯化，再通过肠激酶酶切后得到逆转录酶(MMLV-RT)。

所述表达宿主菌是Escherichiacoli BL21(DE3)。

本发明的优点是：通过载体构建将MMLV-RT基因和肠激酶酶切位点克隆到pET28a载体中，在低温的条件下MMLV-RT与分子伴侣共表达，使表达蛋白的可溶性大大增加。另外，组氨酸标签和肠激酶酶切位点的加入则使反转录酶的纯化更加简化、高效。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明：

图1是融合蛋白His6-MMLV-RT在大肠杆菌中的表达：

图1A是重组表达载体pET28-MMLV-RT的质粒图谱：

图1B是重组His6-MMLV-RT蛋白表达的SDS-PAGE分析：

图2是逆转录酶表达条件的优化：

图2A是低温发酵和分子伴侣共表达对逆转录酶可溶性的影响：

图2B是在不同条件下，His6-MMLV可溶性和产量的比较：