[发明专利]一种对乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体进行共检的悬浮芯片检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学检测技术领域，即一种对乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体进行共检的悬浮芯片检测方法。

背景技术

随着我国对外开放程度的不断加大，出入境的人员往来大幅度增多，国境口岸传染病监测的工作任务越来越繁重；以SARS和禽流感为典型的新发现传染病对我国的公共卫生安全体系构成严峻的挑战，国境卫生检疫防线更是承受巨大压力和风险。现实迫切呼唤既准确可靠又灵敏高效的检测技术发挥作用，构筑安全可靠的国境卫生检疫防线，悬浮芯片技术正是满足这一实际需求的理想选择。我们瞄准国境口岸常规监测的传染病乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋，研制出了多病原体同时检测的悬浮蛋白芯片系统，把检验检疫人员从繁重的实验中解放出来，提升我国卫生检疫的技术水平，把好国门，保障人民的生命安全，促进改革开放，服务对外贸易和经济发展。目前TP(梅毒)是用TRUST初筛TPPA确认；HIV(艾滋)用ELISA初筛，用WB确认；HBV(乙肝)和HCV(丙肝)用ELISA检测。这些方法一次只能检测一种特定的病原，且程序复杂、工作量大、费时、灵敏度不够高。

发明内容

本发明的目的是克服现有病原体检测方法程序复杂、工作量大、费时、灵敏度不够高的缺陷。

本发明的技术解决方案是：一种对乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体进行共检的悬浮芯片，其特殊之处在于，该悬浮芯片是以直径为5.5～6.5μm的塑料色标编码微球为载体，在该载体上包被单克隆乙肝表面抗体、HIV1 gP41抗原、HCVNS3抗原或梅毒TP15抗原。

一种制备上述悬浮芯片的方法，包括以下步骤：

1)活化编码微球：

1.1)首先取3000-5000个编码微球到1.5mL离心管中，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.2)再加入100μL pH 7.4，0.05％TWEEN-20的PBS缓冲液悬浮，震荡30秒后超声30秒，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.3)接着加入80μL 3g NaH₂PO₄，5N NaOH 40drops/250mL H2O的微球活化缓冲液，震荡30秒后超声30秒；

1.4)再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的EDC，紧接着加入10μL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇700rpm，15-25min；

1.5)再加入150μL的pH7.4的PBS，震荡10秒后，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.6)再加入150μL的pH7.4的PBS，震荡10秒后，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.7)最后，加入100μL的pH7.4的PBS悬浮编码微球，震荡300rpm 30秒后，超声15秒，完成编码微球的活化；

2)活化编码微球的包被：

2.1)取单克隆乙肝表面抗体、HIV1 gP41抗原、HCV NS3抗原、梅毒TP15抗原5-50μg分别加入到活化后的各自对应的编码微球中，用pH7.4的PBS从大约120μL定容至500μL，铝箔包裹，在室温震摇700rpm 2h后，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

2.2)用500μL的pH7.4的PBS洗一次，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

2.3)再加入500μL pH7.4的PBS，1％BSA，0.05％Azide的封闭缓冲液悬浮编码微球，震荡300rpm 15秒后，用铝箔包裹，在室温震摇30min，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

2.4)接着加入500μL pH7.4的PBS，1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％Azide的微球保存液洗涤编码微球，15000-17000g离心5-7min，小心吸出上清并弃去；

2.5)最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，完成活化编码微球的包被。

利用上述的悬浮芯片检测待检血清中的乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体的方法，包括以下步骤：

1)每孔加入150μL的检测缓冲液，预湿孔，用真空泵抽干；

2)每孔加入50μL含相应编码微球的工作液，再加入100μL洗液，洗2次，用真空泵抽干；

3)每孔加入50μL待检血清，空白孔加PBS，700rpm 30秒，室温避光震摇300rpm 30min，用真空泵抽干；