[发明专利]一种对乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体进行共检的悬浮芯片检测方法

权利要求书

1.一种对乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体进行共检的悬浮芯片，其特征在于：该悬浮芯片是以直径为5.5～6.5μm的塑料色标编码微球为载体，在该载体上包被单克隆乙肝表面抗体、HIV1 gP41抗原、HCVNS3抗原或梅毒TP15抗原。

2.一种制备权利要求1所述的悬浮芯片的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)活化编码微球：

1.1)首先取3000-5000个编码微球到1.5mL离心管中，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.2)再加入100μL pH 7.4，0.05％TWEEN-20的PBS缓冲液悬浮，震荡30秒后超声30秒，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.3)接着加入80μL 3g NaH₂PO₄，5N NaOH 40drops/250mL H2O的微球活化缓冲液，震荡30秒后超声30秒；

1.4)再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的EDC，紧接着加入10μL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇700rpm，15-25min；

1.5)再加入150μL的pH7.4的PBS，震荡10秒后，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.6)再加入150μL的pH7.4的PBS，震荡10秒后，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

1.7)最后，加入100μL的pH7.4的PBS悬浮编码微球，震荡300rpm 30秒后，超声15秒，完成编码微球的活化；

2)活化编码微球的包被：

2.1)取单克隆乙肝表面抗体、HIV1gP41抗原、HCV NS3抗原、梅毒TP15抗原5-50μg分别加入到活化后的各自对应的编码微球中，用pH7.4的PBS从大约120μL定容至500μL，铝箔包裹，在室温震摇700rpm 2h后，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

2.2)用500μL的pH7.4的PBS洗一次，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

2.3)再加入500μL pH7.4的PBS，1％BSA，0.05％Azide的封闭缓冲液悬浮编码微球，震荡300rpm 15秒后，用铝箔包裹，在室温震摇30min，12000-14000g离心3-5min，小心吸出上清并弃去；

2.4)接着加入500μL pH7.4的PBS，1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％Azide的微球保存液洗涤编码微球，15000-17000g离心5-7min，小心吸出上清并弃去；

2.5)最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，完成活化编码微球的包被。

3.一种利用权利要求1所述的悬浮芯片检测待检血清中的乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病原体的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)每孔加入150μL的检测缓冲液，预湿孔，用真空泵抽干；

2)每孔加入50μL含相应编码微球的工作液，再加入100μL洗液，洗2次，用真空泵抽干；

3)每孔加入50μL待检血清，空白孔加PBS，700rpm 30秒，室温避光震摇300rpm 30min，用真空泵抽干；

4)每孔加入100μL洗液，洗3次，用真空泵抽干；

5)每孔加入50μL 1∶2500的生物素化二抗，用单克隆乙肝表面抗体所包被微球的孔加入生物素化的抗表面抗原的抗体，700rpm 30秒，室温避光300rpm25-35min，用真空泵抽干；

6)每孔加入100μL洗液，洗3次，用真空泵抽干；

7)每孔加入50μL的SA-PE，700rpm 30秒，室温避光300rpm 8-12min，用真空泵抽干；

8)每孔加入100μL洗液，洗3次，用真空泵抽干

9)每孔加入125μL的检测缓冲液，700rpm 30秒；

10)用Bio-Plex悬浮芯片系统读取FMI数值；

11)将每份样品的FMI值与cut-off值对照，高于cut-off值者为阳性，低于cut-off值者为阴性；其中，所述cut-off值是由33份健康人血清的FMI的均值加上2倍标准差而得。