[发明专利]一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸，英文名为S-adenosyl-L-methionine(缩写为SAM、SAMe或AdoMet)，是广泛存在于细胞内参与许多关键生化反应的重要生理活性物质，参与40多种生化反应，主要作为三种代谢途径(转甲基、转硫基、转氨丙基)的前体参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合成和代谢以及抗氧化剂谷胱甘肽的形成，与体内各种解毒过程关系密切，是维护细胞膜正常功能、人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。

临床研究表明，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对人体各组织器官乃至整体健康的发展均有重要作用：(1)保护肝脏：SAM可在体内促进抗氧化剂——胶氨基硫的产生，胶氨基硫可与有毒物质直接结合形成水溶性混合物，从而使之顺利排出人体，从而有助于减轻药品、酒精、化学毒物对肝脏的损害，改善肝硬化，并有助于抑制引发肝癌的因子；(2)改善关节炎：有助于促进软骨组织的形成和修复，减轻关节疼痛、肿胀、僵硬；(3)改善情绪：有助于促进脑部多巴胺及血清素神经递质的新陈代谢，从而提升积极情绪，改善抑郁、沮丧。(4)改善睡眠：SAM对调节睡眠的褪黑激素的合成也非常重要。(5)保健功能：SAM能帮助降低人体高半胱氨酸水平，血液中的高半胱氨酸含量过高，与心脏病、癌症、忧郁症、关节炎和其他疾病密切相关。现在SAM在临床上已被作为治疗胆汁郁积性肝病，抗忧郁和关节炎的处方药广泛应用。

腺苷蛋氨酸的应用价值已不容质疑，现生产技术的落后成为其应用的主要瓶颈，提高生产效率，降低生产成本成为SAM进一步开发的重要研究方向。

发明内容

本发明提供一种提高S-腺苷甲硫氨酸产量的发酵工艺，它可以有效地克服现有生产工艺的缺陷，具有生产菌株生长量大，转化率高，培养条件简单和价格低廉等特点，为在工业生产中应用提供了基础。

本发明的技术方案是这样实现的：

(1)发酵菌株的选择：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC44857，ATCC60593，ATCC66103和ATCC76625菌株之一；

(2)发酵菌株的Genome shuffling改造：将上述菌株分别接种到固体斜面培养基上，pH 6.2-6.8；30-35℃，培养18-24小时后，接种液体培养基，pH6.2-6.8；30-35℃，120-180rpm摇床培养18-24小时，获得4个菌株的液体培养物；

以上4个菌株的液体培养物各取5ml离心收集菌体细胞，分别装在4个50ml无菌离心管中，然后向每个离心管中都加入10ml ST溶液，pH7.4，震荡5分钟，离心弃上清；然后加入蜗牛酶混合液，pH7.4，恒温震荡水浴37℃60-100rpm，震荡20-30分钟，离心弃上清，获得原生质体；

原生质体用10ml ST溶液洗涤三次；然后合并4个离心管的原生质体到一个离心管中，加入30ml PTC溶液，pH7.5，恒温震荡水浴35-37℃ 60-80rpm震荡30-40分钟，进行原生质体融合，融合结束后，离心弃上清得沉淀为融合原生质体，用ST溶液洗涤三次；最后在离心管中加入40ml ST溶液制成轻微震荡制成悬液，菌悬液涂布固体再生培养基，pH5.5-6.2；30℃，培养48小时，用无菌小铲刮取固体再生培养基上的所有菌体混合在一起制备原生质体，再进行原生质体融合，融合原生质体涂布再生平板；如此重复3-5轮；最后一轮获得的再生菌株分别进行液体发酵后利用步骤5的方法评估其液体发酵SAM的产量；SAM产量为10-12g/L的改造菌株；

(3)发酵培养条件的优化：将获得改造菌株接种固体斜面培养基，培养基成分同上，30℃，培养24小时后，接种液体发酵培养基，发酵容器为300ml三角瓶，内装100ml培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120rpm，培养24小时；获得液体发酵液；

(4)综合消除底物对菌株发酵生产能力的影响：将上述菌株接种固体斜面培养基，培养基成分同上，30℃，培养2天后，接种液体发酵培养基，30℃，120rpm摇床培养24小时；发酵过程中，脉冲补加DL-甲硫氨酸，发酵容器为300ml三角瓶，内装100ml培养基，培养温度为30℃，摇床转速为120rpm，脉冲补加方式为发酵培养1-12小时每隔30分钟补加一次，每次补加0.05-0.2g甲硫氨酸，12-24小时每隔10分钟补加一次，每次补加0.1-0.4g甲硫氨酸；培养结束后获得液体发酵液。