[发明专利]一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法。

背景技术

兰州百合(Lilium davidii var.unicolor)是百合科百合属川百合的一个变种，又称大王百合、天百合和平陆百合，是一种多年生鳞茎类草本植物。兰州百合的栽种始于清代同治年间，距今约130多年，由于独特的土壤条件和多年积累的栽培技术，其鳞茎硕大，颜色洁白，鳞片丰满白嫩，质地细腻，营养丰富，口味甜美而幽香；其花单生，大而美丽，香味浓郁，有很高的食用、药用、保健和观赏价值，它不仅是中国百合中的上品，而且是中国唯一的甜百合。我国著名的植物分类学家孔宪武教授曾评价：“兰州百合味极甜美，纤维很少，又毫无苦味，不但闻名全国，亦可称世界第一。”

近年来对兰州百合的研究主要集中在种植栽培、贮存保鲜、化学成分、细胞学、分子学、保健食品开发、杂交育种、组织培养、离体快繁等方面。百合已被国家卫生部确定为“既是食品又是药品”的植物之一，兰州百合的营养成分丰富，包括各种蛋白质、脂肪和维生素等。不仅在营养方面具有重要的价值，而且兰州百合还具有重要药用价值和观赏价值。

我国是百合属植物的故乡，观赏、食用或药用百合的栽培历史十分悠久，具备良好的种质资源基础。但目前我国的百合育种工作十分落后，现有的百合种质资源不仅没有得到充分利用，而且破坏、流失现象十分严重。百合通常采用分球、鳞茎等繁殖，易造成种性退化，品质下降，甚至凝聚病毒。在传统育种手段的基础上，采用现代生物技术已经广泛应用到兰州百合的育种工作中。

农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片断可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中，农杆菌介导的转染方法同其它方法相比具有以下优点：转化效率高，转化效果好，可转移大片断DNA；转移的外源基因成为单拷贝；遗传稳定，并且多数符合孟德尔遗传定律；价格廉价。

但由于兰州百合属于单子叶植物，单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，单子叶植物不能或很少能产生激活Ti质粒Vir区基因的信号分子，无明显的创伤反应，不能形成瘤状物，至今以百合鳞片为受体的农杆菌介导法转化体系仍停留在实验室研究阶段。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法。该方法有效的克服现有的农杆菌介导技术难以应用于禾本科植物遗传转化的缺陷。

实现上述发明目的技术产方案是：一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，具体包括如下步骤：

1)切取组培苗鳞片在分化培养基上暗培养2天作为受体材料；

2)将供体菌株接种到加有卡那霉素、链霉素和利福平的液体培养基上培养，收集菌液，离心，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释至浓度OD600为0.4～0.6；

3)将步骤2)制备的菌液加入液体MS中，放入受体材料进行侵染，把侵染过的鳞片放到滤纸上吸干，接种到含有20mg/L AS和200mg/L头孢霉素(cef)的分化培养基上暗培养3d，而后接种到含有2mg/L代表潮霉素(hyg)的分化培养上，26℃暗培养直至长出抗性芽；

4)将抗性芽移植到继代培养基上进行进一步的筛选培养，待生长至4～5片叶子时，进行生根培养，而后进行移栽。

所述的组培苗鳞片是按照以下步骤制备的：洗去百合鳞茎表面泥土，剥去外层有病斑或机械损伤的鳞片，取中外层无病斑健壮的鳞片，用洗洁精浸泡清洗，然后在自来水下冲洗12h左右，灭菌前再用蒸馏水清洗3次，在超净台上用70％乙醇消毒40s，投入0.1％升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5次，灭菌后的鳞片切成1.0～2.0cm×1.0～2.0cm方块，倒置接种于分化培养基上，在26℃、2000lx、16h每天、光照培养30～60天得组培苗鳞片。

所述的兰州百合组培苗鳞片在26℃暗培养2天。

所述的供体菌株是农杆菌EHA105。

所述的液体LB培养基加入的卡那霉素50～150mg/L、链霉素30～70mg/L和利福平40～800mg/L。

所述的供体菌株在液体培养基上培养条件为28℃，200rpm恒温摇床上24。

所述的离心条件为：5000rpm常温离心10分钟。

所述的侵染条件为：28℃，200rpm摇床上摇动20min。

所述的侵染时还加入20mM的乙酰丁香酮(AS)。

所述的分化培养基为1/2MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。