[发明专利]一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法

权利要求书

1.一种建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)切取组培苗鳞片在分化培养基上暗培养2天作为受体材料；

2)将供体菌株接种到加有卡那霉素、链霉素和利福平的LB液体培养基上培养，收集菌液，离心，倒去上清，沉淀用液体MS溶解并稀释至浓度OD600为0.4～0.6；

3)将步骤2)制备的菌液加入液体MS中，放入受体材料进行侵染，把侵染过的鳞片放到滤纸上吸干，接种到含有20mg/L AS和200mg/L头孢霉素的分化培养基上暗培养3d，而后接种到含有2mg/L代表潮霉素的分化培养基上，26℃暗培养直至长出抗性芽；

4)将抗性芽移植到继代培养基上进行进一步的筛选培养，待生长至4～5片叶子时，进行生根培养，而后进行移栽。

2.根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的组培苗鳞片是按照以下步骤制备的：

洗去百合鳞茎表面泥土，剥去外层有病斑或机械损伤的鳞片，取中外层无病斑健壮的鳞片，用洗洁精浸泡清洗，然后在自来水下冲洗12h左右，灭菌前再用蒸馏水清洗3次，在超净台上用70％乙醇消毒40s，投入0.1％升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5次，灭菌后的鳞片切成1.0～2.0cm×1.0～2.0cm方块，倒置接种于分化培养基上，在26℃、2000lx、16h每天、光照培养30～60天得组培苗鳞片。

3.根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的兰州百合组培苗鳞片在26℃暗培养2天。

4.根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的供体菌株是农杆菌EHA105。

5.根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的液体LB培养基中加入卡那霉素50～150mg/L、链霉素30～70mg/L和利福平40～800mg/L。

6.根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的供体菌株在液体培养基上培养条件为28℃，200rpm恒温摇床上24。

7.根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的离心条件为5000rpm常温离心10分钟。

8.根据权利要求1所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，在28℃，200rpm摇床上摇动20min进行侵染。

9.根据权利要求1～6中任一项所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，在进行侵染时加入20mM的乙酰丁香酮。

10.根据权利要求1～6任一项所述的建立兰州百合农杆菌介导高效转化体系的方法，其特征在于，所述的继代培养基中含有5mg/L的潮霉素和50mg/L的头孢霉素。