[发明专利]从人工栽培的红豆杉枝叶中提取紫杉醇的方法

说明书

技术领域

本发明内容属于生化物品制备技术领域，涉及一种从人工栽培的红豆杉枝叶中提取紫杉醇的方法。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel，taxol)是一种由红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物的树皮、枝叶提取的化学结构复杂、作用机制独特的抗肿瘤药物。天然紫杉醇的来源极为有限，其主要来源于红豆杉或紫杉树皮(Wani等，J.Am.Chem.Soc.1971，93，2325)。红豆杉树种生长极其缓慢，一颗生长百年的老树一般只能剥25kg树皮，若提取1kg纯紫杉醇提供1万2千例癌病患者使用，相当于需3万株红豆杉树的树皮。为了得到紫杉醇，国内外开展了种植矮壮化的红豆杉树、组织培养、半合成和全合成紫杉醇等方法获取紫杉醇原料。但组织培养法获得的产量很小，培养液价格昂贵，全合成得率很小，且疗效不及天然源紫杉醇，成本高，难以商业化应用。半合成方法仍然需要天然红豆杉分离出的紫杉醇半合成的前体10-去乙酰基巴卡丁III等作为起始原料。为了保护天然的红豆杉资源，维护生态环境，用生长快的、有效成分含量较高的人工种植的红豆杉提取紫杉醇是最为有效的途径(高锦明等，紫杉醇资源开发研究，西北林学院学报，1997，12(3)：94；高锦明等，抗癌新药紫杉醇的构效关系，西北农业大学学报，1997，25(5)：96；高锦明等，紫杉醇资源、生物活性和化学合成，世界林业研究，1997，10(6)：38；Gragg等，J.Nat.Prod.，1993，56，1657；Kingston，Phytochemistry，2007，68，1844)。

Miller(J.Org.Chem.，1981，46，1469)用(Taxus wallichiana)树干和树叶，用甲醇提取、浓缩，在己烷和水中分配，用氯仿萃取，浓缩，经几次硅胶柱色谱分离；经二次逆流分配；最后用HPLC分离纯化得到184个组分，所得的紫杉醇纯度99.1％。整个提取纯化过程有八个步骤。Senilh等(J.Nat.Prod.，1984，47，131)用甲醇提取欧洲紫杉(T.baccata)树皮，浓缩后，在二氯甲烷和水中分配，经硅胶柱色谱分离，然后经氧化铝柱色谱分离；再经中压硅胶柱色谱分离；最后用制备高压液相色谱纯化。

Nalr(USP 5,279,949，1994)发明了用红豆杉(T.media cv.Hicksii)的新鲜枝叶提取紫杉醇及其类似物。新鲜枝叶用含水甲醇提取，水溶性组分离心与含紫杉醇的固体沉淀分离，过滤后的滤液用活性炭脱色用硅藻土过滤，滤液挥发至干，经硅胶柱，液相分离得到产物。或者将硅藻土过滤的滤液真空下脱甲醇后，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，经硅胶柱纯化得到产物。Nalr(USP 5,478,736，1995)用甲醇和丙酮萃取新鲜枝叶，可得到较高的紫杉醇产量。二次柱色谱分离，低压硅胶柱色谱分离粗紫杉醇，反相色谱最后纯化。

Polysciences公司从太平洋紫杉树皮中分离紫杉醇。先甲醇或乙醇提取树皮，浓缩；浓缩液用二氯甲烷萃取，浓缩干燥至粉末；粉末用丙醇和里格罗因(1∶1)溶解，不溶组分过滤除去；滤液浓缩，溶于30％丙醇里格罗因溶液，经Florisil柱过滤；从柱中流出的紫杉醇组分结晶纯化二次；结晶的紫杉醇再用硅胶柱中分离，结构相似的产物三尖杉宁碱从紫杉醇中分离出来；从柱中流出的紫杉醇重结晶二次，得到紫杉醇。Rao等(USP5,380,916，1992)介绍了用臭氧处理难分离的杂质组分三尖杉宁碱而得紫杉醇。经反相制备色谱法分离粗产品后，仍含有很难分开的三尖杉宁碱，通入臭氧氧化后，经过反相制备色谱分离得到纯度较高的紫杉醇。该方法要使用二甲硫醚处理溶液中残留的臭氧及重结晶得到紫杉醇纯品。Kingston等(J.Nat.Prod.，1992，55，259)使用氧化剂四氧化锇处理紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物。紫杉醇不与四氧化锇反应，三尖杉宁碱的C-13侧链末端双键被氧化，易与紫杉醇分开。Durand(USP 5,723,635，1998)利用离心分配色谱法分离纯化紫杉醇。用C₁₈反相色谱柱从粗产物中分离纯化紫杉醇，一次处理量较大。主要有四个步骤：在制备规模下，用反相色谱法处理紫杉醇粗提物；从吸附剂上洗脱紫杉醇和其它产物；从洗脱的柱子中回收紫杉醇和类似物；使用臭氧处理最终产物，从而分离除去紫杉醇的类似物。