[发明专利]浒苔微世代的荧光原位杂交检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及绿潮生物检测与监测研究，具体地说是一种浒苔微世代的荧光原位杂交检测方法。

背景技术

基于分子基础(核酸、蛋白、糖蛋白)的检测方法较传统检测方法有很大的优势，种类鉴定更为准确可靠，并能够提供定量信息，可以检测较低丰度的目标微藻种类(大型藻类的微型世代)，使之能在常规监测中使用。由于rRNA基因ITS区的异质性，使得其在各类生物属、种间表现出明显的差异。国际上通常采用ITS区作为各种生物类群属种间分类和系统研究的区域，也是设计探针的首选区域。相对而言，两者之间的转录间隔区ITS区，为高变的区域，为生物各类群属下水平的研究提供较多的信息，是国际上公认的生物各类群属下种间水平研究的一个很好的比较指标，在动植物的分子分类中已得到广泛的使用，在藻类分子鉴定中也已被采用。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种非放射性原位杂交方法，它采用特殊荧光素标记核酸(DNA)探针，对检测细胞内DNA或RNA的特定序列存在与否最为有效。这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，检测到细胞内的核酸序列。FISH技术的基本过程是利用荧光标记的探针在细胞内与特异性互补的核酸序列杂交。通过激发杂交探针的荧光来检测信号，从而检测相应的核苷酸序列。该技术主要的步骤包括：1)样品的固定；2)样品的制备和预处理；3)预杂交；4)探针和样品变性；5)用不同的探针杂交来检测不同的靶序列；6)漂洗去除未结合的探针；7)检测杂交信号，进行结果分析。其关键环节在荧光染料的选择、杂交过程和杂交后检测(Miller et al.，1998；Groben et al.，2005)。FISH技术通常采用的荧光染料是荧光素衍生物(FITC，FluoX)、罗丹明衍生物(TRITC，TexasRed)和吲哚二羧箐(Cy3、Cy5)等，由于吲哚二羧箐具有显著的亮度和光熄灭稳定性，因此具有较好的应用前景。

2007年和2008年，我国黄海中部连续两年爆发浒苔(Enteromorphaprolifera)绿潮。2008年6月初，黄海中南部海域出现历史罕见的大规模的浒苔绿潮现象，并逐渐向青岛近海海域漂移，浒苔绿潮持续时间长、规模大，严重影响到奥帆赛比赛海域环境质量和青岛市区沿海一线景观。由此可见，我国沿海不仅成为中国赤潮发生的重灾区，而且已经成为以大型绿藻浒苔(Enteromorpha prolifera)为代表的绿潮的重灾区，对赤潮、绿潮，特别是绿潮微世代等生物的准确鉴定、快速检测和预警预报已成为当前赤潮和绿潮研究领域的热点问题，并具有重要的理论和实际意义。

针对传统监测方法的困难和限制，国外科学家们已致力于发展各种特异性分子探针来检测各种赤潮类群，使目标赤潮生物能通过光学或化学的手段检测出来，实现快速且准确地鉴定、计数目标绿潮种类，从而确定赤潮的生物量、分布情况，达到准确检测预报绿潮的目的。迄今为止，分子探针技术在赤潮生物检测与监测研究在国际上得到了迅速发展，而针对绿潮的相关研究却特别少，特别是针对浒苔(Enteromorpha prolifera)微世代，即越冬种子库(propagule bank)形式的荧光原位杂交技术还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、准确的浒苔微世代的荧光原位杂交检测方法；它可实现快速且准确地鉴定、计数浒苔，从而确定其生物量、分布情况，达到准确检测预报的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术为：

浒苔微世代的荧光原位杂交检测方法，用于FITC标记原位杂交检测浒苔微世代的寡核苷酸探针为如下4种探针之一或一种以上，

1)5’-GCCCGCCGTTTACAGGAT-3’

2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’

3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’

4)5’-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3’

于它们的5’端采用FITC标记的办法。

用于FITC标记原位杂交检测浒苔微世代的寡核苷酸探针最好为如下2种探针之一或二种，

2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’，

3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’。

原位杂交的具体过程为：

1)样品的制备和预处理