[发明专利]浒苔微世代的荧光原位杂交检测方法

权利要求书

1.浒苔微世代的荧光原位杂交检测方法，其特征在于：

用于FITC标记原位杂交检测浒苔微世代的寡核苷酸探针为如下4种探针之一或一种以上，

1)5’-GCCCGCCGTTTACAGGAT-3’

2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’

3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’

4)5’-GGAGCCCTAACCCATTGAA-3’

于它们的5’端采用FITC标记的办法。

2.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：用于FITC标记原位杂交检测浒苔微世代的寡核苷酸探针为如下2种探针之一或二种，

2)5’-AGCCCTAACCCATTGAACCC-3’，

3)5’-CCCTGCGATAGTAACTGAGACA-3’。

3.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：原位杂交的具体过程为，

1)样品的制备和预处理

将现场海水水体样品进行浓缩后，对藻的自发荧光进行固定、脱色：用离心管于5000g/min离心样品5min，加入乙醇至终体积浓度1％固定，静置1-2小时，得浓缩脱色后的样品，上带有聚碳酸酯膜的过滤器上过滤，使细胞留在聚碳酸酯膜上；分别采用1×PBS和杂交缓冲液过滤清洗滤膜；

2)杂交：将滤膜置于载玻片上，直接加入杂交缓冲液和荧光探针，使探针终浓度达到5-10ng/μL；将玻片置于温湿的暗处46-50℃杂交2-3h；

3)漂洗去除未结合的探针：用预热至50℃的1×SET的杂交清洗液浸泡洗涤滤膜来终止杂交反应，洗涤后用干净滤纸吸干滤膜；

4)检测杂交信号，进行结果分析

加入封片剂和终浓度为1μg/mL DNA标记物DAPI的混合液，复染并防止荧光淬灭。盖上盖玻片并封片，储存于暗处以备检测。杂交后的藻细胞以荧光显微镜观察杂交效果，并记录阳性标记率；观察FITC荧光标记的藻细胞时应用450-490nm的激发光波长、510-520nm发射光波长的滤光片组合观察，观察确认水样中存在的浒苔微世代。

4.按照权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述海水水体样品采集后用筛绢过滤浓缩。

5.按照权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述杂交缓冲液的组成为0.9M NaCl，20mmol/LTris-HCl，pH7.2，0.1％(v/v)Nonidet-P40，20％(v/v)甲酰胺。