[发明专利]红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。

【背景技术】

凝乳酶(chymosin，EC3.4.23.4)是一种从未断奶的小牛皱胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切酪蛋白的κ-酪蛋白中Phe105-Met106连接的肽键，导致牛奶凝结，因此被广泛用于干酪制造业，成为食品领域中重要的酶制剂，其产值占全世界酶制剂的15％。

凝乳酶的传统制备方法是将出生10～30天的小牛屠宰，从其第四胃中用盐将凝乳酶浸提出来。由于凝乳酶是干酪生产中的关键性酶，随着世界干酪产业的不断发展，每年宰杀5000万头犊牛以获得凝乳酶的方法，仍不能满足生产的需要，也与现代化工业发展极不协调。因此，研究者都在不断寻找新的凝乳酶的来源，主要包括动物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物源凝乳酶，但是这几种来源的凝乳酶又都具有一定的局限性。动物性凝乳酶受到来源限制，而且利用动物性凝乳酶生产的干酪不能满足素食主义者的需求。植物性凝乳酶虽然来源广泛，但是受到时间、地域、生长周期长，蛋白水解活性高等条件限制，很难发展。利用微生物生产凝乳酶是目前最有前途的发展方向，微生物生长周期短、产量大，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶的成本较低、酶提取方便、经济效益高，但是同时也存在着微生物产生其它非酶类代谢产物的问题。一般微生物酶在成为商业用酶时，都要进行毒性、致癌性以及皮肤过敏性测试，因而真正用于工业化生产凝乳酶的菌株非常稀少。

红曲米是利用红曲霉生产，古称丹曲，是我国古代的伟大发明。多少年来，红曲不但用于酿酒，而且还应用于发酵食品、食品色素等方面。红曲一直用于我国传统食品豆腐乳的制作，它的安全性是确切有保证的。已经有研究证明红曲米发酵液作为凝乳剂是发酵液中的凝乳酶在发挥作用，红曲米发酵液中的凝乳酶是红曲米发酵液中微生物代谢产物，属于微生物源凝乳酶，由于红曲是我国传统的食品添加剂，所以从红曲米发酵液中提取的凝乳酶无需考虑微生物所产的非酶类代谢产物。利用液态发酵扩大生产，提高凝乳酶的活性具有重要的意义。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种产高活性凝乳酶且可大批量生产的方法。主要工艺路线：利用红曲米，通过液态发酵改变培养基配方及发酵条件控制其代谢生产出凝乳活性较高的凝乳酶。

本发明技术方案如下：

红曲米液态发酵制备凝乳酶的方法，步骤如下：

1)红曲米粉碎成粉状，细度200-400目，将红曲米粉接种到PDA液态培养基中，28-30℃恒温培养90-96h，获得紫红色的红曲霉；红曲霉为紫红色，生长于红曲米的四周。

2)将红色的红曲霉接种至基础发酵培养基，28-30℃恒温培养12h进行扩大培养；

3)将步骤2)扩大培养后的红曲霉按5％(体积比)接种量加入到液体培养基中进行摇床培养，28-30℃，150r/min摇床培养70～72h，得到红曲霉活化液；

4)将步骤3)制得的红曲霉活化液按5％(体积比)接种量接种至发酵罐，通风量20～40L/min，培养温度28～32℃，转速200～350r/min，培养时间72～120h，发酵18h开始流加灭菌的液体培养基，流加速度为0.03L/h，制得红曲霉发酵液；

5)将步骤4)发酵的制得的红曲霉发酵液在4℃、4000r/min条件下离心10min，取上清液备用；

6)向步骤5)得到的上清液中分两次滴加2-3倍体积的乙醇进行醇沉，第一次4℃静置2h后，以7000r/min离心15min，保留沉淀；取上清液，用旋转蒸发仪浓缩后进行二次醇沉，条件为：4℃静置24h，以8000r/min离心15min，取沉淀；合并两次沉淀物，溶于pH 6.2的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液；

7)使用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；

8)利用DEAE-纤维素52对上述洗脱液进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCl梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。

上述步骤2)中的基础发酵培养基组分如下，均为重量百分比：