[发明专利]红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法

权利要求书

1.一种红曲米液态发酵制备凝乳酶的方法，步骤如下：

1)红曲米粉碎成粉状，细度200-400目，将红曲米粉接种到PDA斜面培养基，28-30℃恒温培养90-96h，获得紫红色的红曲霉；红曲霉为紫红色，生长于红曲米的四周；

2)将紫红色的红曲霉接种至基础发酵培养基，28-30℃恒温培养12h进行扩大培养；

3)将步骤2)扩大培养后的红曲霉按体积比5％接种量加入液体培养基进行摇床培养，28-30℃，150r/min摇床培养70-72小时，得到的红曲霉活化液；

4)将步骤3)制得的红曲霉活化液按照体积百分比5％的接种量接种至发酵罐，通风量20-40L/min，培养温度28-32℃，转速200-350r/min，培养时间72-120h，发酵18h开始流加灭菌的液体培养基，流加速度为0.03L/h，制得红曲霉发酵液；

5)将步骤4)发酵的得到的红曲霉发酵液在4℃、4000r/min条件下离心10min，取上清液备用；

6)向步骤5)得到的上清液中分两次滴加2-3倍体积的乙醇进行醇沉，第一次4℃静置2h后，以7000r/min离心15min，保留沉淀；取上清液，用旋转蒸发仪浓缩，第二次4℃静置24h后，以8000r/min离心15min，取沉淀，合并两次沉淀且溶于pH 6.2的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液；

7)使用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；

8)利用DEAE-纤维素52对上述洗脱液进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCl梯度洗脱，分步收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶；

所述步骤2)中的基础发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖为1-1.5％；蛋白胨为0.1-0.5％，KH₂PO₄为0.1-0.5％，K₂HPO₄为0.1-0.5％，酵母粉为0.1-0.2％，MgSO₄·7H₂O为0.02-0.08％，ZnSO₄·7H₂O为0.02-0.05％，余量为蒸馏水，p H为5.0-7.0；

所述步骤3)中的液体培养基组分如下，均为重量百分比：

小麦麸皮水解液为4-8％；硫酸铵为0.2-0.6％，KH₂PO₄为0.1-0.5％，K₂HPO₄为0.1-0.5％，MgSO₄·7H₂O为0.02-0.08％，ZnSO₄·7H₂O为0.02-0.05％，余量为蒸馏水，pH为5.0-7.0；

步骤8)中，所述利用NaCl梯度洗脱为0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L和0.55mol/L浓度的NaCl缓冲液进行梯度洗脱。

2.如权利要求1所述的红曲米液态发酵制备凝乳酶的方法，其特征在于，上述步骤6)中，第一次醇沉中使用的乙醇浓度为72％wt，第二次醇沉中使用的乙醇浓度为95％wt。