[发明专利]检测细菌毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物检测技术领域，具体地说涉及一种检测细菌毒素的糖基功能 化分子印迹膜电极的制备方法，及采用所述的糖基功能化分子印迹膜电极检测环境样本 中痕量细菌毒素的方法。

背景技术

细菌毒素主要有三种：外毒素、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性 蛋白，是细菌在指数生长期分泌的已知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时 就具有很高的毒性。目前细菌毒素已成为迫切需要治理的新一代环境污染物，微量的细 菌毒素即可对正常激素作用产生影响，干扰内分泌机能，引起哺乳动物及人类的生殖障 碍、发育异常及某些病理性损伤。这类物质不仅存在于工业废水、废气和生活污水中， 在农产品中也可能存在。如果细菌毒素残留不能得到及时、准确地检测，它们就可能进 入机体，并在体内直接或间接影响正常的激素代谢，给人类健康带来严重的危害。

因此，建立一种高灵敏度和特异性的快速筛检细菌毒素残留的方法，便成为当前该 研究领域亟需解决的问题之一。目前细菌毒素的检测分析方法主要有生物学方法，如： 动物测毒法和细胞测毒法；免疫学方法，如：有反向被动血凝实验(RPHA)、被动免疫 溶血试验(PIH)、毒素与抗毒素琼脂扩散试验、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附试验 (ELISA)；分子生物学方法，如：PCR法。这些检测方法虽然灵敏度较高，稳定性较好， 但大多都有周期长，过程复杂，费时费力结果准确性低等缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种检测速度快、灵敏度高的检测细菌 毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法。

本发明还提供了使用上述糖基功能化分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

所述的检测细菌毒素的糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，其特殊之处在于包 括以下步骤：

(1)选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；

(2)按一定摩尔比将细菌毒素模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有 机溶剂混合均匀制成糖基功能化分子印迹聚合物溶液；

(3)利用电极表面修饰技术，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面 上。

所述细菌毒素模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的摩尔比 为0.1～2∶2.5∶0.1～5∶40～80∶0.01～0.10∶1.0～15。

所述功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神 经节苷脂或神经酰胺三己糖苷。所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、 氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、杂环化合物酰胺或砜类；所述有机溶剂为二氯 甲烷或四氯化碳。

所述将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面包括以下步骤：

(1)将工作电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再依次用1mol/L HNO₃， 1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，晾干；

(2)将晾干的工作电极浸泡于糖基功能化分子印迹聚合物溶液中5-10分钟，再取出用洗 脱剂洗脱20-30分钟，直至将模板分子完全洗掉，然后在室温下干燥5-10分钟；

(3)重复步骤(2)4-7次，制得所述糖基功能化分子印迹膜电极。

将制得的糖基功能化分子印迹膜电极浸入pH6.8-7.5的缓冲液中，保存在4℃冰箱 12～24h，然后用去离子水彻底清洗。

所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸或乙腈-乙酸。所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。

本发明所述的检测细菌毒素的方法，包括以下步骤：将上述方法制得的糖基功能化 分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。

本发明的有益效果如下：

1.将表面修饰技术应用到糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备当中，使得 糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备具有可控性，提高了电极的灵敏度和准确 性。

2.本发明所得到的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极，可以实现样本中细菌毒 素的高特异性、高灵敏度、快速检测。